Caenorhabditis dauer 유충의 대규모 중력 분석
Summary
본 프로토콜은 Caenorhabditis dauer 유충으로 대규모 중력 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 플레이트 기반 분석과 비교하여 중력 거동을 더 잘 감지할 수 있습니다.
Abstract
중력 감각은 중요하고 상대적으로 덜 연구된 과정입니다. 중력을 감지하면 동물이 주변을 탐색하고 움직임을 용이하게 할 수 있습니다. 또한 포유류의 내이에서 발생하는 중력 감각은 청각과 밀접한 관련이 있으므로 이 과정을 이해하는 것은 청각 및 전정 연구에 영향을 미칩니다. 중력 분석은 초파리를 포함한 일부 모델 유기체에 대해 존재합니다. 단일 웜은 이전에 용액에 정착 할 때 방향 선호도에 대해 분석되었습니다. 그러나, Caenorhabditis 중력에 대한 신뢰할 수 있고 강력한 분석은 기술되지 않았다. 본 프로토콜은 한 번에 수백 개의 Caenorhabditis dauers를 시험하는데 사용될 수 있는 중력 분석을 수행하는 절차를 간략하게 설명한다. 이 대규모 장거리 분석은 상세한 데이터 수집을 허용하여 표준 플레이트 기반 분석에서 놓칠 수 있는 표현형을 밝힙니다. 수직 축을 따라 다우어 움직임을 수평 컨트롤과 비교하여 방향 바이어스가 중력에 의한 것임을 확인합니다. 그런 다음 중력 선호도를 균주 또는 실험 조건 간에 비교할 수 있습니다. 이 방법은 웜의 중력에 대한 분자, 세포 및 환경 요구 사항을 결정할 수 있습니다.
Introduction
지구의 중력을 감지하는 것은 많은 유기체의 방향, 움직임, 조정 및 균형에 매우 중요합니다. 그러나 중력 감각의 분자 메커니즘과 신경 회로는 다른 감각에 비해 잘 이해되지 않습니다. 동물에서 중력 감각은 행동에 영향을 미치는 다른 자극과 상호 작용하고 경쟁할 수 있습니다. 시각적 단서, 고유 감각 피드백 및 전정 정보를 통합하여 동물의 주변 환경에 대한 신체 인식 감각을 생성 할 수 있습니다 1,2. 반대로, 중력 선호도는 다른 자극 3,4,5의 존재 하에서 변경 될 수있다. 따라서 중력 행동은 중력 감각을 연구하고 신경계의 복잡한 감각 통합 및 의사 결정을 이해하는 데 이상적입니다.
C. elegans는 polyphenic 수명주기 때문에 중력을 연구하는 데 특히 유용한 모델 유기체입니다. 발달 중 더위, 과밀 또는 식량 부족을 포함한 스트레스 요인에 노출되면 C. elegans 유충은 스트레스에 강한 다우어로 발달합니다6. dauers로서, 벌레는 벌레가 꼬리에 “서서”머리를 흔드는 nictation과 같은 특징적인 행동을 수행하여 더 나은 서식지로 분산을 촉진 할 수 있습니다7. C. elegans와 C. japonica의 중력 분석은 dauer 유충이 부정적인 중력을 시사하며, 이러한 행동은 성인보다 dauers에서 더 쉽게 관찰됩니다 8,9. 다른 Caenorhabditis 균주에서 중력을 테스트하면 중력 행동의 자연적 변화가 나타날 수 있습니다.
중력 감각에 대한 메커니즘은 유글레나, 초파리, 시오나 및 중력 분석 3,10,11을 사용하는 다양한 다른 종에서 특성화되었습니다. 한편, Caenorhabditis에 대한 중력 연구는 처음에 혼합 된 결과를 제공했습니다. C. elegans 방향 선호도에 대한 연구에 따르면 벌레는 용액에서 머리를 아래로 향하게 하여 긍정적인 중력 선호도를 시사합니다12. 한편, C. japonica dauers는 초기에 음의 중력8로 확인되었지만,이 행동은 최근에야 C. elegans9에서 설명되었습니다. 웜에서 대표적인 중력 분석을 개발하는 데 몇 가지 문제가 발생합니다. Caenorhabditis 균주는 한천 플레이트에서 유지됩니다. 이러한 이유로 행동 분석은 일반적으로 실험 설계13,14,15의 일부로 한천 플레이트를 사용합니다. Caenorhabditis에서 가장 초기에 보고된 중력 분석은 수평 대조군플레이트(8)에 대해 90° 각도로 플레이트를 측면에 세워서 수행되었습니다. 그러나 중력 거동이 이러한 조건에서 항상 견고한 것은 아닙니다. 솔루션12에서 성인 웜의 방향 선호도를 분석할 수 있지만 이 방향 기본 설정은 상황에 따라 달라질 수 있으므로 웜이 수영하지 않고 크롤링하는 경우 다른 동작이 발생할 수 있습니다. 또한, C. elegans는 중력에 대한 반응을 방해하는 빛과 전자기장(16,17)을 포함한 다른 자극에 민감하다9. 따라서 다른 환경 변수로부터 보호하는 업데이트된 중력 분석은 이 감각 과정의 메커니즘을 해부하는 데 중요합니다.
본 프로토콜에서, Caenorhabditis 중력을 관찰하기 위한 분석법이 기재되어 있다. 이 연구의 설정은 부분적으로 신경근 무결성18,19를 연구하기 위해 개발 된 방법을 기반으로합니다. Dauer 유충은 표준 절차20을 사용하여 배양 및 분리됩니다. 그런 다음 한천으로 채워진 두 개의 5mL 혈청 학적 피펫으로 만든 챔버에 주입됩니다. 이 챔버는 수직 또는 수평으로 배향 될 수 있으며 빛과 전자기장으로부터 보호하기 위해 12-24 시간 동안 어두운 패러데이 케이지 내에 배치 할 수 있습니다. 챔버에서 각 웜의 위치가 기록되고 C. elegans N2와 같은 기준 균주의 수직 택시와 비교됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전 방법과의 비교
화학주성과는 달리, Caenorhabditis 의 중력은 전통적인 한천 플레이트 실험 설계를 사용하여 안정적으로 관찰할 수 없습니다. 표준 페트리 접시는 직경이 150mm이므로 다우어가 중력 선호도를 입증하기 위해 어느 방향으로든 75mm만 사용할 수 있습니다. C. elegans의 방향 선호도는 용액12에서 분석할 수 있지만 이 방법은 웜을 한 번에 하?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원에서 JHR (#R01 5R01HD081266 및 #R01GM141493)에 대한 연구 보조금으로 지원되었습니다. 일부 균주는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)가 자금을 지원하는 CGC에서 제공했습니다. 우리는 Pradeep Joshi (UCSB)의 편집 의견에 감사드립니다. UCSB DATALAB에서 제공하는 통계 상담.
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
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