Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması
Summary
Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.
Abstract
Çoğu hücre, temel hücre işlemlerini gerçekleştirmek için şekillerini algılayabilir ve değiştirebilir. Birçok ökaryotta, septin sitoiskeleti, sitokinezi, polarize büyüme ve göç gibi şekil değişikliklerini koordine etmede ayrılmaz bir bileşendir. Septinler, çeşitli üst düzey yapılar oluşturmak için bir araya gelen filament oluşturan proteinlerdir ve çoğu durumda, plazma zarının farklı bölgelerinde, özellikle mikron ölçeğinde pozitif eğrilik bölgelerinde bulunur. Septin montaj sürecinin in vivo olarak izlenmesi, hücrelerdeki ışık mikroskobunun sınırlamalarının yanı sıra hem membranlar hem de sitoiskelet elemanları ile etkileşimlerin karmaşıklığı nedeniyle engellenir ve bu da canlı sistemlerde septin dinamiklerini ölçmeyi zorlaştırır. Neyse ki, son on yılda, septin montajını kontrol eden mekanizmaları yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüklerde incelemek için septin sitoiskeletinin hücresiz bir sistemde yeniden yapılandırılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Septin montajının temel adımları, septin heterooligomer ilişkisi ve membran ile ayrışması, filamentlere polimerizasyon ve filamentler arasındaki etkileşimler yoluyla daha yüksek dereceli yapıların oluşumunu içerir. Burada, septin montajını farklı bağlamlarda gözlemlemek için üç yöntem sunuyoruz: düzlemsel çift katmanlar, küresel destekler ve çubuk destekleri. Bu yöntemler, montajın farklı aşamalarında septinlerin biyofiziksel parametrelerini belirlemek için kullanılabilir: membranı bağlayan tek oktamerler olarak, filamentler olarak ve filamentlerin montajları olarak. Bu parametreleri, eğrilik algılamanın çeşitli uzunluk ve zaman ölçeklerinde nasıl çalıştığını anlamak için eğrilik örneklemesi ve tercihli adsorpsiyon ölçümleriyle birlikte kullanıyoruz.
Introduction
Hücrelerin şekilleri ve iç bölmelerinin çoğu, onları çevreleyen lipit zarlarına bağlıdır. Membranlar, proteinlerle etkileşimler, lipit sıralama ve çeşitli şekiller üretmek için iç ve dış kuvvetlere etki ederek deforme olabilen viskoelastik yapılardır 1,2,3,4. Bu şekiller genellikle membran eğriliği açısından tanımlanır. Hücreler, hücre kaçakçılığı, sitokinezi ve migrasyon dahil olmak üzere süreçler üzerinde tanımlanmış mekansal-zamansal kontrol sağlamak için tercihen belirli membran eğriliklerine monte edilebilen veya “algılayabilen” çeşitli protein paketlerini kullanır 5,6. Membrandaki hücre makinelerinin dinamiklerini, zamanı ve mekansal çözünürlüğü hücre sağlığı ile dengelemenin zorluğu nedeniyle gözlemlemek özellikle zordur. Süper çözünürlük teknikleri bu tür yapıların ayrıntılı bir görünümünü sunabilse de, çoğu makine için montaj / demontaj zaman çizelgelerine uygun olmayan uzun kazanımlar gerektirir. Ek olarak, bu montajların doğal ortamlarındaki moleküler karmaşıklığı ve tek bir bileşenin oynayabileceği rollerin çokluğu, minimal sulandırma sistemlerini moleküllerin fonksiyonel kapasitesini incelemek için değerli bir araç haline getirmektedir.
Membran özelliklerini ve hücre dışındaki protein-membran etkileşimlerini incelemek için minimal membran mimetiği geliştirilmiştir. Membran mimetiği, lipozomlar veya dev unilamellar veziküller gibi serbest duran lipit çift katmanlarından, desteklenen lipit çift katmanlarına (SLB’ler) kadar değişir7,8,9,10. SLB’ler, tipik olarak cam, mika veya silika 11,12’den oluşan, altta yatan desteğe tutturulmuş biyomimetik membranlardır. Düzlemsel yüzeyler, küreler, çubuklar ve hatta hem içbükey hem de dışbükey eğrilikler üzerindeki protein-membran etkileşimlerini aynı anda araştırmak için dalgalı veya mikro desenli substratlar dahil olmak üzere çeşitli geometriler kullanılabilir1 3,14,15,16,17,18 . Çift katmanlı oluşum, hidrofilik bir yüzeye vezikül adsorpsiyonu ile başlar, ardından sürekli bir çift katmanlı oluşturmak için füzyon ve kopma ile devam eder (Şekil 1)19. Desteklenen çift katmanlar, ışık ve elektron mikroskobuna özellikle uygundur ve hücrelerde sıklıkla elde edilebilenden daha iyi zaman ve uzamsal çözünürlük sağlar. Kavisli SLB’ler özellikle önemli membran deformasyonunun yokluğunda protein eğrilik hassasiyetini araştırmak için çekici bir araç sağlar ve serbest sistemlerde ayrılması genellikle imkansız olan eğrilik algılama ve eğrilik indüksiyonu arasında ayrım yapılmasına izin verir.
Septinler, pozitif kavisli membranlar üzerinde birleşme yetenekleri ile iyi bilinen bir filament oluşturan sitoiskelet proteinleri sınıfıdır 6,18,20. Mayadaki hücre döngüsü boyunca, septinler bir halka halinde toplanır ve sırasıyla tomurcuk oluşumu ve sitokinezi ile ilişkili kum saati ve çift halka yapılarını oluşturmak için yeniden düzenlenmelidir21. Değişen hücre döngüsü aşamaları22’de septin mimarisini gözlemlemek için platin replika elektron mikroskobu kullanılarak güzel çalışmalar yapılmış olsa da, mayada ışık mikroskobu kullanarak zaman içinde septin montajını izlemek sınırlı uzamsal çözünürlükle karşılanmıştır. İletim elektron mikroskobu (TEM) ile görselleştirilen lipit monokatmanlarını kullanan septinler üzerinde yapılan önceki çalışmalar, halkalar, demetler ve gazlı bezler gibi birkaç ilginç septin yapısını yeniden oluşturabildi23. Bununla birlikte, EM teknikleri, floresan mikroskobundan farklı olarak, zamansal çözünürlüklerinde de sınırlıdır. Çok ölçekli septin montajı sürecinin kinetik parametrelerini daha iyi çözmek için, membran geometrisini, numune koşullarını ve görüntüleme modalitesini dikkatlice kontrol edebilen desteklenen membran mimetiğine yöneldik.
Burada açıklanan protokoller düzlemsel veya kavisli SLB’ler, saflaştırılmış protein ve mikroskopi tekniklerinin bir kombinasyonunu kullanır. Kantitatif floresan konfokal mikroskopi ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM), hem çeşitli membran eğriliklerine bağlı dökme proteini ölçmek hem de tek moleküllerin bağlanma kinetiğini ölçmek için kullanıldı. Ayrıca, bu protokol, farklı membran eğriliklerinde protein ultrayapısını incelemek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Bu protokollerin odak noktası septin sitoiskeleti üzerinde olsa da, protokoller okuyucunun ilginç bulduğu herhangi bir proteinin eğrilik duyarlılığını araştırmak için kolayca değiştirilebilir. Ek olarak, endositoz veya veziküler kaçakçılık gibi alanlarda çalışanlar, bu teknikleri çoklu protein komplekslerinin eğriliğe bağlı gruplarını araştırmak için yararlı bulabilirler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre zarları birçok farklı şekil, eğrilik ve fizikokimyasal özellik kazanır. Hücrelerin mikrometre ölçeğinde montajlar oluşturduğu nanometre ölçekli makineleri incelemek için, membran mimetiklerinin minimal sulandırma sistemlerini tasarlamak gerekir. Bu protokol, hem membran eğriliğini hem de bileşimi hassas bir şekilde kontrol eden teknikler sunarken, kullanıcının yaygın olarak bulunan mikroskopi tekniklerini kullanarak kantitatif floresan ölçümlerini kolayca almasını sağlar.
<p clas…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibe No tarafından desteklenmiştir. R01 GM-130934 ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) MCB-2016022 hibe eder. B.N.C, E.J.D.V. ve K.S.C., T32 GM119999 ödülü kapsamında Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü’nden bir hibe ile kısmen desteklenmiştir.
Materials
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22×22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
Riferimenti
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
- Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Biologia dello sviluppo. 401 (1), 92-102 (2015).
- Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
- Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
- Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
- Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
- Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
- Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
- Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
- Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
- Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
- Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Lou, H. -. Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
- Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
- Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
- Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
- Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
- Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
- Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
- Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
- Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
- Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
- Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
- Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
- Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
- Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
