Mikrofluidik-assisteret selektiv depolarisering af aksonale mitokondrier
Summary
Den nuværende protokol beskriver såning og farvning af neuronale mitokondrier i mikrofluidiske kamre. Den flydende trykgradient i disse kamre muliggør selektiv behandling af mitokondrier i axoner for at analysere deres egenskaber som reaktion på farmakologiske udfordringer uden at påvirke cellelegemets rum.
Abstract
Mitokondrier er de primære leverandører af ATP (adenosintrifosfat) i neuroner. Mitokondrie dysfunktion er en almindelig fænotype i mange neurodegenerative sygdomme. I betragtning af nogle axoners udførlige arkitektur og ekstreme længde er det ikke overraskende, at mitokondrier i axoner kan opleve forskellige miljøer sammenlignet med deres cellekropsmodstykker. Interessant nok går dysfunktion af aksonale mitokondrier ofte forud for virkninger på cellekroppen. For at modellere aksonal mitokondriel dysfunktion in vitro tillader mikrofluidiske enheder behandling af aksonale mitokondrier uden at påvirke de somale mitokondrier. Den flydende trykgradient i disse kamre forhindrer diffusion af molekyler mod gradienten, hvilket muliggør analyse af mitokondrieegenskaber som reaktion på lokale farmakologiske udfordringer inden for axoner. Den nuværende protokol beskriver såning af dissocierede hippocampale neuroner i mikrofluidiske enheder, farvning med et membranpotentielt følsomt farvestof, behandling med et mitokondrietoksin og den efterfølgende mikroskopiske analyse. Denne alsidige metode til at studere aksonal biologi kan anvendes på mange farmakologiske forstyrrelser og billeddannelsesaflæsninger og er velegnet til flere neuronale undertyper.
Introduction
Mitokondrier er de vigtigste leverandører af ATP (adenosintrifosfat) i neuroner. Da neuronal sundhed er tæt forbundet med mitokondriefunktion, er det ikke overraskende, at dysfunktionel regulering af disse organeller har været forbundet med begyndelsen af forskellige neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom1. Desuden er mitokondriel forgiftning med succes blevet brugt til at modellere Parkinsons symptomer hos dyr2. I både dyremodeller og menneskelig sygdom starter neuronernes død ved de distale dele3,4, hvilket antyder, at aksonale mitokondrier kan være mere modtagelige for fornærmelser. Imidlertid er mitokondriernes biologi i axoner ikke godt forstået på grund af de vanskeligheder, der er forbundet med målrettet behandling og analyse af aksonale mitokondrier uden samtidig forstyrrelse af cellekropsprocesser.
Nylige fremskridt inden for dyrkningsteknikker af dissocierede neuroner in vitro tillader nu fluidisk adskillelse af axoner og cellelegemer gennem mikrofluidiske enheder5. Som vist i figur 1A har disse enheder fire adgangsbrønde (a/h og c/i), med to kanaler, der forbinder hvert par (d og f). De store kanaler er forbundet med hinanden med en serie på 450 μm lange mikrokanaler (e). Forsætlige forskelle i påfyldningsniveauerne mellem de to kamre skaber en væsketrykgradient (figur 1B), der forhindrer diffusion af små molekyler fra kanalen med et lavere væskeniveau til den anden side (figur 1C, illustreret med Trypan blåt farvestof).
Vi brugte for nylig mikrofluidiske enheder til at studere lokale oversættelseskrav i aksonal mitofagi, selektiv fjernelse af beskadigede mitokondrier6. I den nuværende protokol præsenteres forskellige trin for at inducere lokal mitokondrieskade gennem selektiv behandling af axoner ved anvendelse af mitokondriekomplekset III-hæmmeren Antimycin A 6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol beskriver en metode til frø og kultur dissocierede hippocampus neuroner i en mikrofluidisk enhed til behandling af aksonale mitokondrier separat. Nytten af denne tilgang med det membranfølsomme farvestof TMRE og den komplekse III-hæmmer Antimycin A (som tidligere demonstreret7) demonstreres her, men denne metode kan let tilpasses andre mitokondriefarvestoffer eller genetisk kodede sensorer af mitokondriefunktioner, der tillader lokale, mikroskopibaserede udlæsninger<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af den tyske forskningsfond (HA 7728/2-1 og EXC2145 Project ID 390857198) og Max Planck Society.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
Riferimenti
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson’s disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
