Despolarización selectiva asistida por microfluídica de mitocondrias axonales

Summary

El presente protocolo describe la siembra y tinción de mitocondrias neuronales en cámaras microfluídicas. El gradiente de presión fluídica en estas cámaras permite el tratamiento selectivo de las mitocondrias en los axones para analizar sus propiedades en respuesta a desafíos farmacológicos sin afectar el compartimento del cuerpo celular.

Abstract

Las mitocondrias son los principales proveedores de ATP (trifosfato de adenosina) en las neuronas. La disfunción mitocondrial es un fenotipo común en muchas enfermedades neurodegenerativas. Dada la elaborada arquitectura y la longitud extrema de algunos axones, no es sorprendente que las mitocondrias en los axones puedan experimentar diferentes entornos en comparación con sus contrapartes del cuerpo celular. Curiosamente, la disfunción de las mitocondrias axonales a menudo precede a los efectos en el cuerpo celular. Para modelar la disfunción mitocondrial axonal in vitro, los dispositivos microfluídicos permiten el tratamiento de las mitocondrias axonales sin afectar a las mitocondrias somales. El gradiente de presión fluídica en estas cámaras evita la difusión de moléculas contra el gradiente, lo que permite el análisis de las propiedades mitocondriales en respuesta a los desafíos farmacológicos locales dentro de los axones. El protocolo actual describe la siembra de neuronas disociadas del hipocampo en dispositivos microfluídicos, la tinción con un tinte sensible al potencial de membrana, el tratamiento con una toxina mitocondrial y el posterior análisis microscópico. Este método versátil para estudiar la biología axonal se puede aplicar a muchas perturbaciones farmacológicas y lecturas de imágenes, y es adecuado para varios subtipos neuronales.

Introduction

Las mitocondrias son los principales proveedores de ATP (trifosfato de adenosina) en las neuronas. Como la salud neuronal está íntimamente ligada a la función mitocondrial, no es sorprendente que la regulación disfuncional de estos orgánulos se haya asociado con la aparición de diversas enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson¹. Además, la intoxicación mitocondrial se ha utilizado con éxito para modelar los síntomas parkinsonianos en animales². Tanto en modelos animales como en enfermedades humanas, la desaparición de las neuronas comienza en las partes distales^3,4, lo que sugiere que las mitocondrias axonales podrían ser más susceptibles a los insultos. Sin embargo, la biología de las mitocondrias en los axones no se comprende bien debido a las dificultades asociadas con el tratamiento dirigido y el análisis de las mitocondrias axonales sin perturbación simultánea de los procesos del cuerpo celular.

Los recientes avances en las técnicas de cultivo de neuronas disociadas in vitro permiten ahora la separación fluídica de axones y cuerpos celulares a través de dispositivos microfluídicos⁵. Como se muestra en la Figura 1A, estos dispositivos cuentan con cuatro pozos de acceso (a/h y c/i), con dos canales que conectan cada par (d y f). Los canales grandes están conectados entre sí por una serie de microcanales de 450 μm de largo (e). Las diferencias intencionales en los niveles de llenado entre las dos cámaras crean un gradiente de presión de fluido (Figura 1B) que evita la difusión de moléculas pequeñas desde el canal con un nivel de fluido más bajo hacia el otro lado (Figura 1C, ilustrada con colorante azul de tripano).

Recientemente utilizamos dispositivos microfluídicos para estudiar los requisitos de traducción local en la mitofagia axonal, la eliminación selectiva de las mitocondrias dañadas⁶. En el presente protocolo, se presentan diferentes pasos para inducir daño mitocondrial local a través del tratamiento selectivo de los axones utilizando el inhibidor del complejo mitocondrial III Antimicina A ^6,7.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo las directrices y reglamentos pertinentes del Gobierno de Alta Baviera. Las neuronas primarias se prepararon a partir de embriones de ratón de tipo salvaje E16.5 C57BL / 6 de ambos sexos siguiendo los métodos estándar descritos anteriormente6. 1. Montaje del dispositivo microfluídico Cubra una placa de cultivo de tejido con fondo de vidrio de seis pocillos con una concentración f…

Representative Results

Las neuronas primarias del hipocampo se cultivaron en dispositivos microfluídicos durante 7-8 días antes de que las mitocondrias se tiñeran con el tinte sensible a la membrana (TMRE) durante 25 minutos en ambos canales. Como se muestra en la Figura 2A, esto produjo una tinción homogénea de las mitocondrias en ambos lados de los microsurcos, pero fue insuficiente para equilibrar la tinción en el medio de los microsurcos. Tras la adición de antimicina A al lado axonal, las mitocondrias …

Discussion

El presente protocolo describe un método para sembrar y cultivar neuronas disociadas del hipocampo en un dispositivo microfluídico para tratar las mitocondrias axonales por separado. La utilidad de este enfoque con el colorante sensible a la membrana TMRE y el inhibidor del complejo III Antimicina A (como se demostró anteriormente⁷) se demuestra aquí, pero este método puede adaptarse fácilmente a otros colorantes mitocondriales o sensores codificados genéticamente de funciones mitocondriale…

Materials

6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917