Despolarização Seletiva Assistida por Microfluídica das Mitocôndrias Axonais

Summary

O presente protocolo descreve a semeadura e coloração de mitocôndrias neuronais em câmaras microfluídicas. O gradiente de pressão fluídica nessas câmaras permite o tratamento seletivo de mitocôndrias em axônios para analisar suas propriedades em resposta a desafios farmacológicos sem afetar o compartimento do corpo celular.

Abstract

As mitocôndrias são os principais fornecedores de ATP (trifosfato de adenosina) nos neurônios. A disfunção mitocondrial é um fenótipo comum em muitas doenças neurodegenerativas. Dada a arquitetura elaborada e o comprimento extremo de alguns axônios, não é surpreendente que as mitocôndrias nos axônios possam experimentar ambientes diferentes em comparação com suas contrapartes do corpo celular. Curiosamente, a disfunção das mitocôndrias axonais muitas vezes precede os efeitos no corpo celular. Para modelar a disfunção mitocondrial axonal in vitro, os dispositivos microfluídicos permitem o tratamento das mitocôndrias axonais sem afetar as mitocôndrias somais. O gradiente de pressão fluídica nessas câmaras impede a difusão de moléculas contra o gradiente, permitindo assim a análise das propriedades mitocondriais em resposta a desafios farmacológicos locais dentro dos axônios. O protocolo atual descreve a semeadura de neurônios hipocampais dissociados em dispositivos microfluídicos, coloração com um corante sensível ao potencial de membrana, tratamento com uma toxina mitocondrial e a subsequente análise microscópica. Este método versátil para estudar a biologia axonal pode ser aplicado a muitas perturbações farmacológicas e leituras de imagem, e é adequado para vários subtipos neuronais.

Introduction

As mitocôndrias são os principais fornecedores de ATP (trifosfato de adenosina) nos neurônios. Como a saúde neuronal está intimamente ligada à função mitocondrial, não é de surpreender que a regulação disfuncional dessas organelas tenha sido associada ao aparecimento de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson¹. Além disso, a intoxicação mitocondrial tem sido utilizada com sucesso para modelar sintomas parkinsonianos em animais². Tanto em modelos animais quanto em doenças humanas, o desaparecimento dos neurônios começa nas partes distais^3,4, sugerindo que as mitocôndrias axonais podem ser mais suscetíveis a insultos. No entanto, a biologia das mitocôndrias nos axônios não é bem compreendida devido às dificuldades associadas ao tratamento direcionado e à análise das mitocôndrias axonais sem perturbação simultânea dos processos do corpo celular.

Avanços recentes em técnicas de cultura de neurônios dissociados in vitro agora permitem a separação fluídica de axônios e corpos celulares através de dispositivos microfluídicos⁵. Conforme mostrado na Figura 1A, esses dispositivos apresentam quatro poços de acesso (a/h e c/i), com dois canais conectando cada par (d e f). Os grandes canais estão conectados uns com os outros por uma série de microcanais de 450 μm de comprimento (e). Diferenças intencionais nos níveis de enchimento entre as duas câmaras criam um gradiente de pressão do fluido (Figura 1B) que impede a difusão de pequenas moléculas do canal com um nível de fluido mais baixo para o outro lado (Figura 1C, ilustrada com corante azul de Trypan).

Recentemente, utilizamos dispositivos microfluídicos para estudar os requisitos de tradução local na mitofagia axonal, a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas⁶. No presente protocolo, diferentes etapas são apresentadas para induzir dano mitocondrial local por meio do tratamento seletivo de axônios utilizando o inibidor do complexo mitocondrial III Antimicina A ^6,7.

Protocol

Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo as diretrizes e regulamentos relevantes do Governo da Alta Baviera. Os neurônios primários foram preparados a partir de embriões de camundongos do tipo selvagem E16.5 C57BL/6 de ambos os sexos, seguindo métodos padrão, conforme descrito anteriormente6. 1. Montagem do dispositivo microfluídico Revestir uma placa de cultura de tecido com fundo de vidro de seis poços com uma concen…

Representative Results

Os neurônios primários do hipocampo foram cultivados em dispositivos microfluídicos por 7-8 dias antes que as mitocôndrias fossem coradas com o corante sensível à membrana (TMRE) por 25 minutos em ambos os canais. Como mostrado na Figura 2A, isso produziu coloração homogênea de mitocôndrias em ambos os lados dos microsulcos, mas foi insuficiente para equilibrar a coloração no meio dos microsulcos. Após a adição de Antimicina A ao lado axonal, as mitocôndrias sanais retiveram …

Discussion

O presente protocolo descreve um método para semear e cultivar neurônios hipocampais dissociados em um dispositivo microfluídico para tratar mitocôndrias axonais separadamente. A utilidade dessa abordagem com o corante sensível à membrana TMRE e o inibidor do complexo III Antimicina A (como demonstrado anteriormente⁷) é demonstrada aqui, mas esse método pode ser facilmente adaptado a outros corantes mitocondriais ou sensores geneticamente codificados de funções mitocondriais que permitem…

Materials

6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917