Zellfreie Proteinsynthese aus Exonuklease-defizienten Zellextrakten unter Verwendung linearer DNA-Vorlagen
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Pufferkalibrierung von Zellextrakten aus Exonuklease-V-Knockout-Stämmen von Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD und ΔrecB) vorgestellt. Dies ist ein schneller, einfacher und direkter Ansatz für die Expression in zellfreien Proteinsynthesesystemen mit linearen DNA-Vorlagen.
Abstract
Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist in letzter Zeit aufgrund ihrer zahlreichen Vorteile im Bereich der synthetischen Biologie sehr populär geworden. Die Verwendung linearer DNA-Templates für CFPS wird es der Technologie ermöglichen, ihr volles Potenzial auszuschöpfen und die experimentelle Zeit zu verkürzen, indem die Schritte des Klonens, der Transformation und der Plasmidextraktion eliminiert werden. Lineare DNA kann schnell und einfach durch PCR amplifiziert werden, um hohe Konzentrationen der Vorlage zu erhalten, wodurch eine mögliche In-vivo-Expressionstoxizität vermieden wird. Lineare DNA-Templates werden jedoch durch Exonukleasen, die natürlicherweise in den Zellextrakten vorhanden sind, schnell abgebaut. Es gibt mehrere Strategien, die vorgeschlagen wurden, um dieses Problem anzugehen, wie die Zugabe von Nukleaseinhibitoren oder die chemische Modifikation linearer DNA-Enden zum Schutz. Alle diese Strategien kosten zusätzliche Zeit und Ressourcen und müssen noch plasmidnahe Proteinexpressionswerte erreichen. Ein detailliertes Protokoll für eine alternative Strategie zur Verwendung linearer DNA-Templates für CFPS wird hier vorgestellt. Durch die Verwendung von Zellextrakten aus Exonuklease-defizienten Knockout-Zellen bleiben lineare DNA-Templates intakt, ohne dass Endmodifikationen erforderlich sind. Wir stellen die Herstellungsschritte von Zelllysat aus Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD Stamm durch Ultraschalllyse und Pufferkalibrierung für Mg-Glutamat (Mg-glu) und K-Glutamat (K-glu) speziell für lineare DNA vor. Diese Methode ist in der Lage, Proteinexpressionsniveaus zu erreichen, die mit denen von Plasmid-DNA in E. coli CFPS vergleichbar sind.
Introduction
Zellfreie Proteinsynthesesysteme (CFPS) werden zunehmend als schnelle, einfache und effiziente Methode für die Biosensortechnik, die dezentrale Herstellung und das Prototyping genetischer Schaltkreise eingesetzt1. Aufgrund ihres großen Potenzials werden CFPS-Systeme regelmäßig im Bereich der synthetischen Biologie eingesetzt. Bisher sind CFPS-Systeme jedoch auf zirkuläre Plasmide angewiesen, die das volle Potenzial der Technologie einschränken können. Die Herstellung von Plasmid-DNA hängt von vielen zeitaufwändigen Schritten während der Klonierung und großen Mengen an DNA-Isolierung ab. Auf der anderen Seite kann die PCR-Amplifikation aus einem Plasmid oder einer synthetisierten DNA-Vorlage verwendet werden, um CFPS-Templates einfach innerhalb weniger Stunden herzustellen 2,3. Daher bietet die Anwendung von linearer DNA eine vielversprechende Lösung für CFPS. Lineare DNA wird jedoch schnell durch Exonukleasen abgebaut, die natürlicherweise in zellulären Extrakten vorkommen4. Es gibt Lösungen, die dieses Problem angehen, wie die Verwendung des λ-Phagen-GamS-Proteins5 oder DNA, die Chi-Stellen6 enthält, als Schutzmittel oder der direkte Schutz der linearen DNA durch chemische Modifikation ihrer Enden 2,7,8,9. Alle diese Methoden erfordern Ergänzungen des Zellextrakts, die kostspielig und zeitaufwendig sind. Es ist seit langem bekannt, dass der Exonuklease-V-Komplex (RecBCD) lineare DNA inZelllysaten abbaut4. Kürzlich haben wir gezeigt, dass lineare DNA in Lysaten aus Zellen, die für Exonuklease-Gene (recBCD) ausgeschaltet wurden, viel besser geschützt werden kann10.
In diesem Protokoll werden Schritte zur Herstellung zellfreier Lysate aus dem E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-Stamm durch Ultraschalllyse detailliert beschrieben. Die Beschallungslyse ist eine gängige und erschwingliche Technik, die von mehreren Labors eingesetztwird 11,12. Die aus diesem Stamm hergestellten Extrakte benötigen keine zusätzliche Komponente oder DNA-Vorlagenmodifikation, um die Expression aus linearen DNA-Templates zu unterstützen. Die Methode beruht auf dem wesentlichen Schritt der Pufferoptimierung für Zellextrakte speziell für die lineare DNA-Expression aus nativen E. coli-Promotoren. Es hat sich gezeigt, dass diese spezifische Pufferoptimierung für die lineare DNA-Expression der Schlüssel für native σ70-Promotoren ist, um eine hohe Proteinproduktion ohne GamS-Protein- oder Chi-DNA-Supplementierung zu erzielen und sogar die Reinigung der PCR-Produkte zu vermeiden10. Es wurde festgestellt, dass die optimale Konzentration von Mg-glu für die lineare DNA-Expression ähnlich der für Plasmid-DNA ist. Die optimale Konzentration von K-glu zeigte jedoch einen wesentlichen Unterschied zwischen linearer und Plasmid-DNA, wahrscheinlich aufgrund eines transkriptionsbezogenen Mechanismus10. Die Funktionalität von Proteinen, die mit dieser Methode exprimiert werden, wurde für verschiedene Anwendungen nachgewiesen, wie z.B. das schnelle Screening von Zehengriffschaltern und die Aktivitätsbewertung von Enzymvarianten10.
Dieses Protokoll bietet eine einfache, effiziente und kostengünstige Lösung für die Verwendung linearer DNA-Templates in zellfreien E. coli-Systemen durch einfache Verwendung mutierter ΔrecBCD-Zellextrakte und spezifischer Kalibrierung für lineare DNA als Vorlage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir, dass Zelllysat, hergestellt aus E. coli BL21 Rosetta2 mit einem genomischen Knockout für recB – oder recBCD-Operon , eine hohe Proteinexpression aus linearen DNA-Vorlagen unterstützt. Dieses Protokoll erarbeitet ein schrittweises Lysat-Kalibrierungsverfahren speziell für lineare DNA-Templates (Abbildung 2), ein kritischer Schritt, der zur hohen Expression von σ70-Promotoren in linearer DNA führt und plasmidnahe Konzentrationen für äquimolare…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB und JLF bestätigen die finanzielle Unterstützung durch den ANR SINAPUV-Zuschuss (ANR-17-CE07-0046). JLF und JB bestätigen die finanzielle Unterstützung durch den ANR SynBioDiag-Zuschuss (ANR-18-CE33-0015). MSA und JLF bestätigen die finanzielle Unterstützung durch den ANR iCFree-Zuschuss (ANR-20-BiopNSE). JB dankt dem ERC für die Unterstützung von “COMPUCELL” (Fördernummer 657579). Das Centre de Biochimie Structurale dankt der französischen Infrastruktur für integrierte Strukturbiologie (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK dankt der finanziellen Unterstützung durch die MICA-Abteilung von INRAe, die Université Paris-Saclay, das DIM-RFSI der Region Ile-de-France (IdF) und ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Diese Arbeit wurde durch den European Research Council Consolidator Award (865973 an CLB) gefördert.
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
Riferimenti
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