סינתזת חלבונים נטולת תאים מתמציות תאיות חסרות אקסונוקלאז תוך שימוש בתבניות DNA ליניאריות
Summary
מוצג כאן פרוטוקול להכנה וכיול חיץ של תמציות תאים מזני נוקאאוט אקסונוקלאז V של Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD ו– ΔrecB). זוהי גישה מהירה, קלה וישירה לביטוי במערכות סינתזת חלבונים נטולות תאים באמצעות תבניות דנ”א ליניאריות.
Abstract
סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) הפכה לאחרונה לפופולרית מאוד בתחום הביולוגיה הסינתטית בשל יתרונותיה הרבים. שימוש בתבניות דנ”א ליניאריות עבור CFPS יאפשר עוד יותר לטכנולוגיה למצות את מלוא הפוטנציאל שלה, ויקצר את זמן הניסוי על ידי ביטול שלבי השיבוט, הטרנספורמציה ומיצוי הפלסמיד. ניתן להגביר את הדנ”א הליניארי במהירות ובקלות על ידי PCR כדי להשיג ריכוזים גבוהים של התבנית, תוך הימנעות מרעילות פוטנציאלית של ביטוי in vivo . עם זאת, תבניות דנ”א ליניאריות מתפרקות במהירות על-ידי אקסונוקלאזות שנמצאות באופן טבעי בתמציות התאים. ישנן מספר אסטרטגיות שהוצעו כדי להתמודד עם בעיה זו, כגון הוספת מעכבי נוקלאז או שינוי כימי של קצוות DNA ליניאריים להגנה. כל האסטרטגיות הללו עולות זמן ומשאבים נוספים ועדיין אינן משיגות רמות כמעט פלסמידים של ביטוי חלבונים. פרוטוקול מפורט לאסטרטגיה חלופית מוצג כאן לשימוש בתבניות DNA ליניאריות עבור CFPS. על-ידי שימוש בתמציות תאים מתאי נוקאאוט עם מחסור באקסונוקלאז, תבניות דנ”א ליניאריות נשארות שלמות ללא צורך בשינויי קצה כלשהם. אנו מציגים את שלבי ההכנה של ליזאט תאים מזן Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD על ידי תזה סוניקטיבית וכיול חיץ עבור Mg-גלוטמט (Mg-glu) ו- K-גלוטמט (K-glu) במיוחד עבור DNA ליניארי. שיטה זו מסוגלת להשיג רמות ביטוי חלבון דומות לאלה של דנ”א פלסמיד ב- E. coli CFPS.
Introduction
מערכות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) משמשות יותר ויותר כשיטה מהירה, פשוטה ויעילה להנדסת ביו-סנסורים, ייצור מבוזר ויצירת אב-טיפוס של מעגלים גנטיים1. בשל הפוטנציאל הגדול שלהם, מערכות CFPS משמשים באופן קבוע בתחום הביולוגיה הסינתטית. עם זאת, עד כה מערכות CFPS מסתמכות על פלסמידים מעגליים שיכולים להגביל את הטכנולוגיה מלהגיע למלוא הפוטנציאל שלה. הכנת דנ”א פלסמיד תלויה בשלבים רבים שגוזלים זמן רב במהלך השיבוט ובכמויות גדולות של בידוד דנ”א. מצד שני, ניתן להשתמש בהגברת PCR מפלסמיד, או מתבנית DNA מסונתזת, כדי פשוט להכין תבניות CFPS תוך מספר שעות 2,3. לכן, יישום של DNA ליניארי מציע פתרון מבטיח עבור CFPS. עם זאת, דנ”א ליניארי מתפרק במהירות על-ידי אקסונוקלאזות הנמצאות באופן טבעי בתמציות תאים4. ישנם פתרונות המטפלים בבעיה זו, כגון שימוש בחלבון λ-phage GamS5 או DNA המכיל אתרי צ’י6 כסוכני הגנה, או הגנה ישירה על הדנ”א הליניארי על ידי שינוי כימי של קצותיו 2,7,8,9. כל השיטות הללו דורשות תוספי מזון לתמצית התא, שהם יקרים וגוזלים זמן רב. זה ידוע כבר זמן רב כי קומפלקס אקסונוקלאז V (RecBCD) משפיל דנ”א ליניארי בתאיםליזטים 4. לאחרונה, הראינו שדנ”א ליניארי יכול להיות מוגן הרבה יותר טוב בליזאטים מתאים שהוצאו עבור גנים של אקסונוקלאז (recBCD)10.
בפרוטוקול זה, צעדים להכנת ליזטים ללא תאים מזן E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD על ידי סוניקציה ליזיס מתוארים בפירוט. סוניקציה ליזה היא טכניקה נפוצה ובמחיר סביר בשימוש על ידי מספר מעבדות11,12. התמציות המופקות מזן זה אינן זקוקות לתוספת של כל רכיב נוסף או שינוי בתבנית דנ”א כדי לתמוך בביטוי מתבניות דנ”א ליניאריות. השיטה מסתמכת על השלב החיוני של אופטימיזציה של חיץ עבור תמציות תאים במיוחד לביטוי DNA ליניארי ממקדמי E. coli מקומיים. הוכח כי אופטימיזציה ספציפית זו של חיץ לביטוי DNA ליניארי היא המפתח עבור מקדמי σ70 מקומיים להניב ייצור חלבון גבוה ללא חלבון GamS או תוספת DNA צ’י, אפילו הימנעות טיהור של מוצרי PCR10. הריכוז האופטימלי של Mg-glu לביטוי DNA ליניארי נמצא דומה לזה של דנ”א פלסמיד. עם זאת, הריכוז האופטימלי של K-glu הראה הבדל משמעותי בין דנ”א ליניארי לפלסמיד, ככל הנראה בשל מנגנון הקשורלתעתוק 10. הפונקציונליות של חלבונים המתבטאים בשיטה זו הוכחה עבור מספר יישומים, כגון סריקה מהירה של מתגי toehold והערכת פעילות של גרסאות אנזים10.
פרוטוקול זה מספק פתרון פשוט, יעיל וחסכוני לשימוש בתבניות דנ”א ליניאריות במערכות ללא תאי E. coli פשוט על ידי שימוש בתמציות תאים מוטנטיות ΔrecBCD וכיול ספציפי לדנ”א ליניארי כתבנית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מראים כי ליזאט תאים שהוכן מ- E. coli BL21 Rosetta2 עם נוקאאוט גנומי עבור אופרון recB או recBCD תומך בביטוי חלבון גבוה מתבניות DNA ליניאריות. פרוטוקול זה מפרט הליך כיול ליזאט שלב אחר שלב הספציפי לתבניות דנ”א ליניאריות (איור 2), שהוא שלב קריטי שמוביל לביטוי גבוה של מקדמי ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB ו-JLF מכירים בתמיכה במימון על ידי מענק ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF ו-JB מכירים בתמיכה במימון על ידי מענק ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA ו-JLF מכירים בתמיכה במימון על ידי מענק ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB מאשרת תמיכה מה-ERC החל מ-“COMPUCELL” (מספר מענק 657579). המרכז לביוכימי סטרוקטורלה (Centre de Biochimie Structurale) מכיר בתמיכת התשתית הצרפתית לביולוגיה מבנית משולבת (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). ח”כ מודה על תמיכה במימון ממחלקת MICA של INRAe, אוניברסיטת פריז-סקלי, DIM-RFSI של אזור איל-דה-פראנס (IdF) ו-ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). עבודה זו נתמכה על ידי מימון באמצעות פרס המאגד של מועצת המחקר האירופית (865973 ל-CLB).
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
Riferimenti
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
- Schinn, S. -. M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
- Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
- Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
- Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
