Quantificazione della caspasi-9 immunocolorata nel tessuto retinico
Summary
Qui è presentato un protocollo immunoistochimico dettagliato per identificare, convalidare e indirizzare le caspasi funzionalmente rilevanti nei tessuti complessi.
Abstract
La famiglia delle caspasi è nota per mediare molti percorsi cellulari oltre la morte cellulare, tra cui la differenziazione cellulare, il pathfinding assonale e la proliferazione. Dall’identificazione della famiglia delle proteasi di morte cellulare, c’è stata una ricerca di strumenti per identificare ed espandere la funzione di specifici membri della famiglia negli stati di sviluppo, salute e malattia. Tuttavia, molti degli strumenti di caspasi attualmente disponibili in commercio che sono ampiamente utilizzati non sono specifici per la caspasi mirata. In questo rapporto, delineiamo l’approccio che abbiamo utilizzato per identificare, convalidare e indirizzare la caspasi-9 nel sistema nervoso utilizzando un nuovo inibitore e approcci genetici con letture immunoistochimiche. In particolare, abbiamo utilizzato il tessuto neuronale retinico come modello per identificare e convalidare la presenza e la funzione delle caspasi. Questo approccio consente l’interrogazione delle funzioni apoptotiche e non apoptotiche specifiche della caspasi-9 del tipo cellulare e può essere applicato ad altri tessuti complessi e caspasi di interesse. Comprendere le funzioni delle caspasi può aiutare ad ampliare le attuali conoscenze in biologia cellulare e può anche essere vantaggioso per identificare potenziali bersagli terapeutici a causa del loro coinvolgimento nella malattia.
Introduction
Le caspasi sono una famiglia di proteasi che regolano la morte cellulare dello sviluppo, le risposte immunitarie e la morte cellulare aberrante nella malattia 1,2. Mentre è ben noto che i membri della famiglia delle caspasi sono indotti in una varietà di malattie neurodegenerative, capire quale caspasi guida la patologia della malattia è più difficile3. Tali studi richiedono strumenti per identificare, caratterizzare e convalidare la funzione dei singoli membri della famiglia delle caspasi. L’analisi delle singole caspasi rilevanti è importante sia da un punto di vista meccanicistico che terapeutico, poiché la letteratura ha molteplici studi che forniscono prove dei diversi ruoli delle caspasi 4,5. Pertanto, se l’obiettivo è quello di indirizzare una caspasi in una malattia per un beneficio terapeutico, è fondamentale avere un targeting specifico dei membri della famiglia rilevanti. Le tecniche tradizionali per rilevare i livelli di caspasi nei tessuti includono western blotting e approcci enzimatici e fluorometrici 3,6. Tuttavia, nessuna di queste misure consente il rilevamento specifico delle cellule dei livelli di caspasi e, in alcuni scenari, le caspasi scisse spesso non possono essere rilevate dalle tradizionali misure di analisi delle proteine. È noto che le caspasi possono svolgere diversi ruoli apoptotici e non apoptotici nello stesso tessuto7, pertanto è necessaria un’attenta caratterizzazione dei livelli di caspasi cellulo-specifici per una comprensione accurata dei percorsi di sviluppo e malattia.
Questo studio mostra l’attivazione e la funzione delle caspasi in un modello di ipossia neurovascolare-ischemia – occlusione venosa retinica (RVO)7,8. In un tessuto complesso come la retina, ci sono più tipi di cellule che possono essere influenzate dall’ipossia-ischemia indotta nella RVO, comprese le cellule gliali, i neuroni e la vascolarizzazione7. Nella retina del topo adulto, c’è pochissima espressione di caspasi evidente nel tessuto sano, misurata dall’immunoistochimica (IHC)7, ma questo non è il caso durante lo sviluppo9 o nei modelli di malattia retinica10,11. L’IHC è una tecnica ben consolidata nella ricerca biomedica che ha permesso la validazione di bersagli patologici e patologici, l’identificazione di nuovi ruoli attraverso la localizzazione spaziale e la quantificazione delle proteine. Nei casi in cui i prodotti di caspasi scissa non possono essere rilevati mediante western blot o analisi fluorometrica, né la posizione cellulare specifica di caspasi distinte o l’interrogazione delle vie di segnalazione della caspasi attraverso la localizzazione, allora IHC dovrebbe essere utilizzato.
Al fine di determinare le caspasi funzionalmente rilevanti nella RVO, IHC è stato utilizzato con anticorpi convalidati per caspasi e marcatori cellulari. Gli studi precedenti condotti in laboratorio hanno dimostrato che la caspasi-9 è stata rapidamente attivata in un modello di ictus ischemico e inibizione della caspasi-9 con un inibitore altamente specifico protetto dalla disfunzione neuronale e dalla morte12. Poiché la retina fa parte del sistema nervoso centrale (SNC), funge da sistema modello per interrogare e studiare ulteriormente il ruolo della caspasi-9 nelle lesioni neurovascolari13. A tal fine, il modello murino di RVO è stato utilizzato per studiare la posizione e la distribuzione specifiche delle cellule della caspasi-9 e la sua implicazione nel danno neurovascolare. RVO è una causa comune di cecità negli adulti in età lavorativa che deriva da lesioni vascolari14. È stato scoperto che la caspasi-9 era espressa in modo non apoptotico nelle cellule endoteliali, ma non nei neuroni.
Come tessuto, la retina ha il vantaggio di essere visualizzata come un flatmount, che consente l’apprezzamento delle reti vascolari, o come sezioni trasversali, che evidenzia gli strati retinici neuronali. La quantificazione dell’espressione della proteina caspasi nelle sezioni trasversali fornisce il contesto per quanto riguarda quale caspasi è potenzialmente critica nella connettività neuronale retinica e nella funzione di visione identificando la localizzazione delle caspasi nella retina. Dopo l’identificazione e la convalida, il targeting della caspasi di interesse viene ottenuto utilizzando la delezione inducibile cellulo-specifica della caspasi identificata. Per potenziali indagini terapeutiche, la rilevanza delle caspasi di interesse è stata testata utilizzando strumenti specifici per inibire la caspasi attivata. Per la caspasi-9 una cellula comprendeva inibitore altamente selettivo 7,15, Pen1-XBIR3 è stato utilizzato. Per questo rapporto, sono stati utilizzati ceppi C57BL/6J maschili di 2 mesi e ceppo knockout endoteliale inducibile da tamoxifene-9 (iEC Casp9KO) con sfondo C57BL/6J. Questi animali sono stati esposti al modello murino di RVO e C57BL/6J sono stati trattati con l’inibitore selettivo della caspasi-9, Pen1-XBir3. La metodologia descritta può essere applicata ad altri modelli di malattia nei sistemi centrale e periferico 7,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le caspasi sono una famiglia multi-membro di proteasi meglio studiata per i loro ruoli nella morte cellulare e nell’infiammazione; Tuttavia, più recentemente sono state scoperte una varietà di funzioni non di morte per alcuni membri della famiglia 4,5. Gran parte della nostra comprensione della funzione delle caspasi deriva dal lavoro sulla coltura cellulare e dai dati inferenziali delle malattie umane. Mentre è apprezzato che vi sia un’induzione, attivazione …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE – 1644869 e dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) del National Institutes of Health (NIH), numero di premio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (a CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (a AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT), e il Dipartimento della Difesa Esercito/Aeronautica (da DURIP a CMT).
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
Riferimenti
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