रेटिना ऊतक में इम्यूनोस्टेन्ड कैस्पेज़ -9 का परिमाणीकरण
Summary
यहां प्रस्तुत जटिल ऊतकों में कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक कैसपेस की पहचान, सत्यापन और लक्ष्य करने के लिए एक विस्तृत इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल है।
Abstract
कैसपेस का परिवार कोशिका मृत्यु से परे कई सेलुलर मार्गों को मध्यस्थ करने के लिए जाना जाता है, जिसमें सेल भेदभाव, अक्षीय पाथफाइंडिंग और प्रसार शामिल हैं। कोशिका मृत्यु प्रोटीज के परिवार की पहचान के बाद से, विकास, स्वास्थ्य और रोग की स्थिति में विशिष्ट परिवार के सदस्यों के कार्य को पहचानने और विस्तारित करने के लिए उपकरणों की खोज की गई है। हालांकि, वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कैसपेज़ उपकरणों में से कई जो व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, लक्षित कैसपेज़ के लिए विशिष्ट नहीं हैं। इस रिपोर्ट में, हम इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रीड-आउट के साथ एक नए अवरोधक और आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करके तंत्रिका तंत्र में कैसपेज़ -9 को पहचानने, मान्य करने और लक्षित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण को चित्रित करते हैं। विशेष रूप से, हमने कैसपेस की उपस्थिति और कार्य की पहचान और मान्य करने के लिए एक मॉडल के रूप में रेटिना न्यूरोनल ऊतक का उपयोग किया। यह दृष्टिकोण सेल-प्रकार विशिष्ट एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक कैसपेज़ -9 कार्यों की पूछताछ को सक्षम बनाता है और इसे अन्य जटिल ऊतकों और रुचि के कैसपेस पर लागू किया जा सकता है। कैसपेस के कार्यों को समझना सेल जीव विज्ञान में वर्तमान ज्ञान का विस्तार करने में मदद कर सकता है, और बीमारी में उनकी भागीदारी के कारण संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए भी फायदेमंद हो सकता है।
Introduction
कैसपेस प्रोटीज का एक परिवार है जो रोग 1,2 में विकासात्मक कोशिका मृत्यु, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और असामान्य कोशिका मृत्यु को नियंत्रित करता है। हालांकि यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि कैसपेज़ परिवार के सदस्यों को विभिन्न प्रकार के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में प्रेरित किया जाता है, यह समझना कि कौन सा कैसपेज़ रोग विकृति चलाता है, अधिक चुनौतीपूर्ण है। इस तरह के अध्ययनों में व्यक्तिगत कैसपेस परिवार के सदस्यों के कार्य को पहचानने, चिह्नित करने और मान्य करने के लिए उपकरणों की आवश्यकता होती है। प्रासंगिक व्यक्तिगत कैसपेस को पार्स करना एक यंत्रवत और चिकित्सीय दृष्टिकोण दोनों से महत्वपूर्ण है, क्योंकि साहित्य में कैसपेज़ 4,5 की विविध भूमिकाओं के प्रमाण प्रदान करने वाले कई अध्ययन हैं। इस प्रकार, यदि लक्ष्य चिकित्सीय लाभ के लिए किसी बीमारी में कैसपेस को लक्षित करना है, तो संबंधित परिवार के सदस्य (ओं) का विशिष्ट लक्ष्यीकरण करना महत्वपूर्ण है। ऊतक में कैसपेज़ के स्तर का पता लगाने के लिए पारंपरिक तकनीकों में पश्चिमी सोख्ता और एंजाइमेटिक और फ्लोरोमेट्रिक दृष्टिकोण 3,6 शामिल हैं। हालांकि, इनमें से कोई भी उपाय कैस्पेस स्तरों के सेल-विशिष्ट पता लगाने की अनुमति नहीं देता है, और कुछ परिदृश्यों में, क्लीवर कैसपेस को अक्सर पारंपरिक प्रोटीन विश्लेषण उपायों द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है। यह ज्ञात है कि कैसपेस एक ही ऊतक7 में विभिन्न एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक भूमिका निभा सकते हैं, इसलिए विकास और रोग मार्गों की सटीक समझ के लिए सेल-विशिष्ट कैसपेज़ स्तरों के सावधानीपूर्वक लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है।
यह अध्ययन न्यूरोवास्कुलर हाइपोक्सिया-इस्किमिया के एक मॉडल में कैसपेस सक्रियण और कार्य दिखाता है – रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ) 7,8। रेटिना जैसे जटिल ऊतक में, कई सेल प्रकार होते हैं जो आरवीओ में प्रेरित हाइपोक्सिया-इस्केमिया से प्रभावित हो सकते हैं, जिसमें ग्लियल कोशिकाएं, न्यूरॉन्स और वास्कुलचर7 शामिल हैं। वयस्क माउस रेटिना में, स्वस्थ ऊतक में कैस्पेस की बहुत कम अभिव्यक्ति होती है, जैसा कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) 7 द्वारा मापा जाता है, लेकिन विकास9 के दौरान या रेटिना रोग10,11 के मॉडल में ऐसा नहीं है। आईएचसी एक ऐसी तकनीक है जो बायोमेडिकल अनुसंधान में अच्छी तरह से स्थापित है और रोग और पैथोलॉजिकल लक्ष्यों के सत्यापन, स्थानिक स्थानीयकरण के माध्यम से नई भूमिकाओं की पहचान और प्रोटीन की मात्रा का ठहराव की अनुमति दी है। ऐसे मामलों में जहां क्लीवर कैसपेज़ उत्पादों को पश्चिमी धब्बा या फ्लोरोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है, न ही स्थानीयकरण के माध्यम से अलग-अलग कैसपेज़ के विशिष्ट सेल स्थान या कैसपेज़ सिग्नलिंग मार्गों की पूछताछ, तो आईएचसी का उपयोग किया जाना चाहिए।
आरवीओ में कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक कैस्पेस (ओं) को निर्धारित करने के लिए, आईएचसी का उपयोग कैसपेस और सेलुलर मार्करों के लिए मान्य एंटीबॉडी के साथ किया गया था। प्रयोगशाला में किए गए पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कैस्पेस -9 को इस्केमिक स्ट्रोक के एक मॉडल में तेजी से सक्रिय किया गया था और कैसपेज़ -9 के निषेध के साथ न्यूरोनल डिसफंक्शन और मृत्यु12 से संरक्षित एक अत्यधिक विशिष्ट अवरोधक था। क्योंकि रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का हिस्सा है, यह न्यूरोवास्कुलर चोटों13 में कैसपेज़ -9 की भूमिका को क्वेरी करने और आगे की जांच करने के लिए एक मॉडल सिस्टम के रूप में कार्य करता है। इसके लिए, आरवीओ के माउस मॉडल का उपयोग कैस्पेज़ -9 के सेल-विशिष्ट स्थान और वितरण और न्यूरोवास्कुलर चोट में इसके निहितार्थ का अध्ययन करने के लिए किया गया था। आरवीओ कामकाजी वृद्ध वयस्कों में अंधापन का एक सामान्य कारण है जो संवहनी चोट14 के परिणामस्वरूप होता है। यह पाया गया कि कैसपेज़ -9 को एंडोथेलियल कोशिकाओं में गैर-एपोप्टोटिक तरीके से व्यक्त किया गया था, लेकिन न्यूरॉन्स में नहीं।
एक ऊतक के रूप में, रेटिना को या तो एक फ्लैटमाउंट के रूप में कल्पना करने का लाभ होता है, जो संवहनी नेटवर्क की सराहना की अनुमति देता है, या क्रॉस-सेक्शन के रूप में, जो न्यूरोनल रेटिना परतों पर प्रकाश डालता है। क्रॉस-सेक्शन में कैसपेज़ प्रोटीन अभिव्यक्ति का परिमाणीकरण संदर्भ प्रदान करता है, जिसके बारे में रेटिना में कैसपेज़ (ओं) के स्थानीयकरण की पहचान करके रेटिना न्यूरोनल कनेक्टिविटी और दृष्टि समारोह में कैसपेज़ संभावित रूप से महत्वपूर्ण है। पहचान और सत्यापन के बाद, पहचाने गए कैसपेज़ के इंड्यूसेबल सेल विशिष्ट विलोपन का उपयोग करके रुचि के कैसपेज़ का लक्ष्यीकरण प्राप्त किया जाता है। संभावित चिकित्सीय पूछताछ के लिए, सक्रिय कैसपेज़ को रोकने के लिए विशिष्ट उपकरणों का उपयोग करके रुचि के कैसपेस की प्रासंगिकता का परीक्षण किया गया था। कैसपेज़ -9 के लिए एक सेल अत्यधिक चयनात्मक अवरोधक 7,15, पेन 1-एक्सबीआईआर 3 का उपयोग किया गया था। इस रिपोर्ट के लिए, सी 57बीएल / 6 जे पृष्ठभूमि के साथ 2 महीने के, पुरुष सी 57बीएल / 6 जे स्ट्रेन और टैमोक्सीफेन-इंड्यूसेबल एंडोथेलियल कैस्पेज़ -9 नॉकआउट (आईईसी कैस्प 9 केओ) स्ट्रेन का उपयोग किया गया था। इन जानवरों को आरवीओ के माउस मॉडल के संपर्क में लाया गया था और सी 57बीएल / 6 जे को कैसपेज़ -9 चयनात्मक अवरोधक, पेन 1-एक्सबीर 3 के साथ इलाज किया गया था। वर्णित पद्धति को केंद्रीय और परिधीय प्रणालियों 7,15 में रोग के अन्यमॉडलों पर लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैसपेस प्रोटीज का एक बहु-सदस्यीय परिवार है जो कोशिका मृत्यु और सूजन में उनकी भूमिकाओं के लिए सबसे अच्छा अध्ययन किया जाता है; हालांकि, हाल ही में कुछ परिवारके सदस्यों के लिए विभिन्न प्रकार ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम (एनएसएफ-जीआरएफपी) अनुदान डीजीई – 1644869 और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (एनआईएनडीएस) द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच), पुरस्कार संख्या एफ 99एनएस 124180 एनआईएच एनआईएनडीएस विविधता विशेष एफ 99 (सीकेसीओ को), राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (एनईआई) 5 टी 32 ईवाई013933 (एएमपी के लिए), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (आरओ 1 एनएस 1 एनएस 1 एनएस 08) द्वारा समर्थित किया गया था। आर03 एनएस099920 से सीएमटी तक, और रक्षा सेना / वायु सेना विभाग (डीयूआरआईपी से सीएमटी)।
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
Riferimenti
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