Cuantificación de caspasa-9 inmunoteñida en tejido retiniano
Summary
Aquí se presenta un protocolo detallado de inmunohistoquímica para identificar, validar y apuntar a caspasas funcionalmente relevantes en tejidos complejos.
Abstract
Se sabe que la familia de caspasas media muchas vías celulares más allá de la muerte celular, incluida la diferenciación celular, la búsqueda de caminos axonales y la proliferación. Desde la identificación de la familia de proteasas de muerte celular, se han buscado herramientas para identificar y ampliar la función de miembros específicos de la familia en estados de desarrollo, salud y enfermedad. Sin embargo, muchas de las herramientas de caspasa disponibles comercialmente actualmente que se utilizan ampliamente no son específicas para la caspasa dirigida. En este informe, delineamos el enfoque que hemos utilizado para identificar, validar y atacar la caspasa-9 en el sistema nervioso utilizando un nuevo inhibidor y enfoques genéticos con lecturas inmunohistoquímicas. Específicamente, utilizamos el tejido neuronal retiniano como modelo para identificar y validar la presencia y función de las caspasas. Este enfoque permite la interrogación de las funciones apoptóticas y no apoptóticas específicas de tipo celular caspasa-9 y se puede aplicar a otros tejidos complejos y caspasas de interés. Comprender las funciones de las caspasas puede ayudar a ampliar el conocimiento actual en biología celular, y también puede ser ventajoso para identificar posibles objetivos terapéuticos debido a su participación en la enfermedad.
Introduction
Las caspasas son una familia de proteasas que regulan la muerte celular del desarrollo, las respuestas inmunes y la muerte celular aberrante en la enfermedad 1,2. Si bien es bien sabido que los miembros de la familia de las caspasas son inducidos en una variedad de enfermedades neurodegenerativas, comprender qué caspasa impulsa la patología de la enfermedad es más difícil3. Tales estudios requieren herramientas para identificar, caracterizar y validar la función de los miembros individuales de la familia de caspasas. El análisis de las caspasas individuales relevantes es importante tanto desde un punto de vista mecanicista como terapéutico, ya que la literatura tiene múltiples estudios que proporcionan evidencia de los diversos roles de las caspasas 4,5. Por lo tanto, si el objetivo es apuntar a una caspasa en una enfermedad para obtener un beneficio terapéutico, es fundamental tener una orientación específica de los miembros relevantes de la familia. Las técnicas tradicionales para detectar los niveles de caspasa en el tejido incluyen Western blot y enfoques enzimáticos y fluorométricos 3,6. Sin embargo, ninguna de estas medidas permite la detección específica de células de los niveles de caspasas, y en algunos escenarios, las caspasas escindidas a menudo no pueden detectarse mediante las medidas tradicionales de análisis de proteínas. Se sabe que las caspasas pueden desempeñar diferentes funciones apoptóticas y no apoptóticas en el mismo tejido7, por lo tanto, se necesita una caracterización cuidadosa de los niveles de caspasa específicos de las células para una comprensión precisa de las vías de desarrollo y enfermedad.
Este estudio muestra la activación y función de la caspasa en un modelo de hipoxia-isquemia neurovascular – oclusión de la vena retiniana (OVR)7,8. En un tejido complejo como la retina, hay múltiples tipos de células que pueden verse afectadas por la hipoxia-isquemia inducida en la OVR, incluidas las células gliales, las neuronas y la vasculatura7. En la retina del ratón adulto, hay muy poca expresión de caspasas evidentes en el tejido sano, medida por inmunohistoquímica (IHC)7, pero ese no es el caso durante el desarrollo9 o en modelos de enfermedad retiniana10,11. IHQ es una técnica bien establecida en la investigación biomédica y ha permitido la validación de dianas patológicas y de enfermedades, la identificación de nuevos roles a través de la localización espacial y la cuantificación de proteínas. En los casos en que los productos de caspasa escindidos no puedan detectarse mediante Western blot o análisis fluorométrico, ni la ubicación celular específica de distintas caspasas o la interrogación de las vías de señalización de caspasas a través de la localización, entonces se debe usar IHQ.
Para determinar la(s) caspasa(s) funcional(es) relevante(s) en la RVO, se utilizó IHQ con anticuerpos validados para caspasas y marcadores celulares. Los estudios previos realizados en el laboratorio mostraron que la caspasa-9 se activó rápidamente en un modelo de accidente cerebrovascular isquémico e inhibición de caspasa-9 con un inhibidor altamente específico protegido de la disfunción neuronal y la muerte12. Debido a que la retina es parte del sistema nervioso central (SNC), sirve como un sistema modelo para consultar e investigar más a fondo el papel de la caspasa-9 en las lesiones neurovasculares13. Con este fin, se utilizó el modelo de ratón de RVO para estudiar la ubicación y distribución específica de la célula de la caspasa-9 y su implicación en la lesión neurovascular. La OVR es una causa común de ceguera en adultos en edad laboral que resulta de una lesión vascular14. Se encontró que la caspasa-9 se expresó de manera no apoptótica en las células endoteliales, pero no en las neuronas.
Como tejido, la retina tiene la ventaja de ser visualizada como un montaje plano, que permite la apreciación de las redes vasculares, o como secciones transversales, que resaltan las capas neuronales de la retina. La cuantificación de la expresión de la proteína caspasa en secciones transversales proporciona un contexto con respecto a qué caspasa es potencialmente crítica en la conectividad neuronal de la retina y la función de la visión mediante la identificación de la localización de la caspasa (s) en la retina. Después de la identificación y validación, la focalización de la caspasa de interés se logra mediante la deleción inducible específica de la célula de la caspasa identificada. Para posibles indagaciones terapéuticas, se probó la relevancia de las caspasas de interés utilizando herramientas específicas para inhibir la caspasa activada. Para la caspasa-9 se utilizó un inhibidor altamente selectivo 7,15 de la célula que significaba Pen1-XBIR3. Para este informe, se utilizó cepa C57BL/6J masculina de 2 meses de edad y cepa knockout endotelial 9 inducible por tamoxifeno (iEC Casp9KO) con antecedentes C57BL/6J. Estos animales fueron expuestos al modelo de ratón de RVO y C57BL / 6J fueron tratados con el inhibidor selectivo de caspasa-9, Pen1-XBir3. La metodología descrita puede ser aplicada a otros modelos de enfermedad en los sistemas central y periférico 7,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las caspasas son una familia de proteasas de varios miembros mejor estudiada por su papel en la muerte celular y la inflamación; Sin embargo, más recientemente se han descubierto una variedad de funciones no mortales para algunos miembros de la familia 4,5. Gran parte de nuestra comprensión de la función de la caspasa se deriva del trabajo en cultivo celular y de datos inferenciales de enfermedades humanas. Si bien se aprecia que hay inducción, activación o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-GRFP) subvención DGE – 1644869 y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), número de premio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (a CKCO), el Instituto Nacional del Ojo (NEI) 5T32EY013933 (a AMP), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT), y el Departamento de Defensa del Ejército / Fuerza Aérea (DURIP a CMT).
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
Riferimenti
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