Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts למודל סרטן הלבלב
Summary
אלושתלים אורתוטופיים סינגניים של אדנוקרצינומה צינורית הלבלב (PDAC) משחזרים את הביולוגיה, הפנוטיפים והתגובות הטיפוליות של תת-סוגי מחלות. בשל התקדמות הגידול המהירה והניתנת לשחזור, הם נמצאים בשימוש נרחב במחקרים פרה-קליניים. כאן, אנו מראים שיטות עבודה נפוצות ליצירת מודלים אלה, הזרקת תרביות PDAC מורין סינגני לתוך הלבלב.
Abstract
אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא מחלה מורכבת מאוד המאופיינת במיקרו-סביבה הטרוגנית של הגידול המורכבת ממגוון רחב של סטרומה, תאי מערכת החיסון, כלי הדם, העצבים ומרכיבי מטריצה חוץ-תאיים. במהלך השנים פותחו מודלים עכבריים שונים של PDAC כדי להתמודד עם האתגרים שמציבים התקדמותו, הפוטנציאל הגרורתי וההטרוגניות הפנוטיפית שלו. השתלות אורתוטופיות של PDAC בעכברים בעלי יכולת חיסונית הראו הבטחה טובה הודות להתקדמות הגידול המהירה והניתנת לשחזור שלהם בהשוואה למודלים של עכברים מהונדסים גנטית. יתר על כן, בשילוב עם יכולתם לחקות את התכונות הביולוגיות שנצפו ב- PDAC אוטוכתוני, מודלים של עכברי אלוגרפט אורתוטופיים מבוססי קו תאים מאפשרים ניסויים בקנה מידה גדול in vivo . לפיכך, מודלים אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקרים פרה-קליניים לניתוח גנוטיפ-פנוטיפ מהיר וניתוח תגובה לתרופות. מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה ניתנת לשחזור וחזקה להזרקה מוצלחת של תרביות תאי PDAC ראשוניים של עכברים ללבלב של עכברים מושתלים סינגניים. בנוסף לפרטים הטכניים, ניתן מידע חשוב שיש לקחת בחשבון לפני ביצוע ניסויים אלה.
Introduction
לאחרונה, PDAC הפך לגורם השלישי המוביל למוות הקשור לסרטן בעולם המערבי1. זה גורם לשיעור התמותה הגבוה ביותר מבין כל סוגי הסרטן ולשיעור הישרדות כולל של 10 שנים של ~1%, שלא השתנה במשך עשרות שנים2. בשל חוסר ההתקדמות בטיפול ב- PDAC, מחלה זו צפויה להפוך לגורם השני המוביל למוות הקשור לסרטן בעשור הבא3.
גידולי PDAC הם ישויות מורכבות המאופיינות במיקרו-סביבה גידולית מגוונת (TME) המורכבת מהרכבה הטרוגנית של רכיבי מטריצה סטרומה, כלי דם, חיסוניים וחוץ-תאיים4. הבדלים בהרכב ה-TME משפיעים על פרוגנוזה של המחלה ועל התגובה לטיפול 4,5,6. ואכן, מחקרים רבים הראו כי תת-הסוג הבסיסי והמזנכימלי של PDAC קשור ל-TME מדכא מערכת החיסון ומראה ירידה בהישרדות וחוסר תגובה לטיפולים 7,8,9,10,11,12. לכן, הבנה עמוקה יותר של ההבדלים בהרכב TME וכיצד תכונות אלה משפיעות על הביולוגיה של הגידול נותרה גורם חשוב לפיתוח טיפולים מדויקים מולקולרית. כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה שמאחורי פנוטיפ מורכב זה ולזהות אסטרטגיות טיפוליות המסוגלות להתגבר על המחסום שה- TME של PDAC מהווה, מודלים in vivo הם הכרחיים.
היבט מרכזי עבור כל מערכת מודל פרה-קליני של סרטן הוא שהיא צריכה לחקות פנוטיפים אנושיים, לשחזר הן את ההטרוגניות הגנטית והן את הסביבה המשלבת את ריבוי אוכלוסיות הסטרומה והחיסון המרכיבות את TME. לכן, בעת בחירת מודלים עכבר למחקר פרה-קליני, יש לקחת בחשבון מספר היבטים. כדי לחקור את האינטראקציה בין הגידול למערכת החיסון, ניתן להזריק שורות תאים סרטניים תואמות היסטו לעכברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית. ברוב המקרים, אלה מוזרקים תת עורית לתוך האגף של העכבר, המאפשר ניטור קל של הגידול על ידי מישוש או בדיקה חזותית. עם זאת, המודלים המתקבלים אינם מחקים את הצמיחה של תאים סרטניים באיבר המוצא שלהם. לכן, השתלות אורתוטופיות הפכו לתקן הזהב עבור מודלים allograft.
לאלוגרפים אורתוטופיים של עכברים יש מספר יתרונות: הם חסכוניים, ניתן ליצור אותם בהליך פשוט יחסית, והתוצאה היא מודלים עם הרכב מולקולרי ידוע, כמו גם התקדמות ופנוטיפ גידול הניתנים לשחזור וצפויים. ואכן, בעוד שמודלים של קסנוגרפט שמקורם במטופלים מייצגים את ההתנהגות של תאי PDAC אנושיים בצורה מדויקת, הצורך בהשתלה בעכברים מדוכאי חיסון כדי למנוע דחיית שתלים מגביל את ניתוח האינטראקציות בין גידול-חיסון לגידול-סטרומה, ומאפשר לחוקרים ללכוד תמונה חלקית בלבד של מורכבות גידולים אלה. לאלוגרפים אורתוטופיים סינגניים של PDAC יש יתרון בהקשר זה גם בהשוואה למודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMM). GEMMs משחזרים במדויק גידולי PDAC אנושיים ואת ההטרוגניות שנצפתה בחולי PDAC. עם זאת, בגלל תכונות אלה, גידולי GEMM יכולים להראות שונות גבוהה בהרכב הגנטי שלהם, התקדמות הגידול, אגרסיביות, התמיינות היסטולוגית והרכב TME. בעוד שזה יכול להיות יתרון במחקרים מסוימים, זה מגביל מחקרי גנוטיפ לפנוטיפ ואת החקירה הממוקדת של פנוטיפים PDAC13. לכן, אלושתלים אורתוטופיים של עכברים מהווים פשרה טובה ומודל לביצוע מחקרי גידול-מארח וטיפול in vivo. מאמר זה מתאר פרוטוקול לניסויי השתלה אורתוטופיים של תאי PDAC מורינים בלבלב העכבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
אלושתלים אורתוטופיים סינגניים של עכברים מייצגים מודל חזק למחקרים פרה-קליניים בשל עלות-תועלתם, יכולת השחזור שלהם והליכי ניסוי פשוטים יחסית13,15. מודלים אלה לא רק מאפשרים לחקור אינטראקציות גידול-מארח, אלא גם מבטיחים את שימור ההטרוגניות הגנטית של הגידולים שמהם…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למתקן בעלי החיים TUM ולמתקן ליבת ההדמיה של המחלקה לרפואה גרעינית, Klinikum rechts der Isar, על תמיכה טכנית מעולה. מחקר זה נתמך על ידי קונסורציום הסרטן הגרמני (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 ו-S01) ל-D.S., קרן וילהלם סנדר (2020.174.1 ו-2017.091.2) ל-D.S. ומועצת המחקר האירופית (ERC CoG מס’ 648521, ל-D.S.).
Materials
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D. Tissue-specific tumorigenesis: Context matters. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 239-253 (2017).
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
