Сингенные мышиные ортотопические аллотрансплантаты для моделирования рака поджелудочной железы
Summary
Сингенные мышиные ортотопные аллотрансплантаты аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC) повторяют биологию, фенотипы и терапевтические реакции подтипов заболевания. Благодаря быстрому и воспроизводимому прогрессированию опухоли они широко используются в доклинических исследованиях. Здесь мы показываем общие методы создания этих моделей, вводя сингенные мышиные культуры PDAC в поджелудочную железу.
Abstract
Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) является очень сложным заболеванием, характеризующимся гетерогенным микроокружением опухоли, состоящим из разнообразной стромы, иммунных клеток, сосудов, нервов и компонентов внеклеточного матрикса. На протяжении многих лет были разработаны различные мышиные модели PDAC для решения проблем, связанных с его прогрессированием, метастатическим потенциалом и фенотипической гетерогенностью. Иммунокомпетентные мышиные ортотопические аллотрансплантаты PDAC показали хорошие перспективы благодаря их быстрому и воспроизводимому прогрессированию опухоли по сравнению с генетически модифицированными моделями мышей. Более того, в сочетании с их способностью имитировать биологические особенности, наблюдаемые в автохтонных PDAC, модели мышей с ортотопическим аллотрансплантатом на основе клеточной линии позволяют проводить крупномасштабные эксперименты in vivo . Таким образом, эти модели широко используются в доклинических исследованиях для быстрого анализа генотипа-фенотипа и лекарственного ответа. Целью этого протокола является обеспечение воспроизводимого и надежного подхода к успешному введению первичных клеточных культур PDAC мыши в поджелудочную железу сингенных мышей-реципиентов. В дополнение к техническим деталям дается важная информация, которую необходимо учитывать перед проведением этих экспериментов.
Introduction
В последнее время PDAC стал третьей по значимости причиной смертности от рака в западном мире1. Это вызывает самый высокий уровень смертности среди всех видов рака и 10-летнюю общую выживаемость ~ 1%, которая не менялась десятилетиями2. Ожидается, что из-за отсутствия прогресса в лечении PDAC это заболевание станет второй по значимости причиной смертности от рака к следующему десятилетию3.
Опухоли PDAC представляют собой сложные образования, характеризующиеся разнообразным микроокружением опухоли (TME), состоящим из гетерогенной сборки компонентов стромы, сосудистых, иммунных и внеклеточного матрикса4. Различия в составе ТМЭ влияют на прогноз заболевания и ответ на терапию 4,5,6. Действительно, многие исследования показали, что базально-подобный мезенхимальный подтип PDAC связан с высокоиммуносупрессивным TME и показывает снижение выживаемости и отсутствие ответа на терапию 7,8,9,10,11,12. Таким образом, более глубокое понимание различий в составе TME и того, как эти особенности влияют на биологию опухоли, остается важным фактором для разработки молекулярно точных методов лечения. Чтобы лучше понять биологию, лежащую в основе этого сложного фенотипа, и определить терапевтические стратегии, способные преодолеть барьер, который представляет собой TME PDAC, необходимы модели in vivo.
Ключевым аспектом любой доклинической модельной системы рака является то, что она должна имитировать фенотипы человека, повторяя как генетическую гетерогенность, так и среду, включающую множество стромальных и иммунных популяций, составляющих TME. Поэтому при выборе моделей мышей для доклинических исследований необходимо учитывать несколько аспектов. Для исследования опухолево-иммунного взаимодействия гистосовместимые линии раковых клеток могут быть введены сингенным иммунокомпетентным мышам. В большинстве случаев они подкожно вводятся в бок мыши, что позволяет легко контролировать опухоль путем пальпации или визуального осмотра. Однако полученные модели не имитируют рост опухолевых клеток в их органе происхождения. Таким образом, ортотопическая трансплантация стала золотым стандартом для моделей аллотрансплантатов.
Мышиные ортотопические аллотрансплантаты имеют ряд преимуществ: они экономически эффективны, могут быть получены с помощью относительно простой процедуры и приводят к моделям с известным молекулярным составом, а также воспроизводимой и предсказуемой прогрессией опухоли и фенотипом. Действительно, в то время как модели ксенотрансплантатов, полученные от пациентов, точно представляют поведение клеток PDAC человека, необходимость имплантации иммунодефицитным мышам, чтобы избежать отторжения трансплантата, ограничивает анализ взаимодействия опухоли с иммунитетом и опухолью со стромой, позволяя исследователям получить лишь частичное изображение сложности этих опухолей. Сингенные ортотопные аллотрансплантаты PDAC имеют преимущество в этом отношении также по сравнению с генно-инженерными моделями мышей (GEMM). GEMM точно повторяют онкогенез PDAC человека и гетерогенность, наблюдаемую у пациентов с PDAC. Однако из-за этих особенностей опухоли GEMM могут демонстрировать высокую дисперсию в своем генетическом составе, прогрессировании опухоли, агрессивности, гистологической дифференцировке и составе TME. Хотя это может быть преимуществом в некоторых исследованиях, это ограничивает исследования генотипа к фенотипу и целенаправленное исследование фенотипов PDAC13. Таким образом, мышиные ортотопические аллотрансплантаты представляют собой хороший компромисс и модель для проведения исследований опухоли-хозяина и лечения in vivo. В этой статье изложен протокол экспериментов по ортотопической трансплантации клеток PDAC мышей в поджелудочную железу мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сингенные мышиные ортотопические аллотрансплантаты представляют собой надежную модель для доклинических исследований благодаря своей экономической эффективности, воспроизводимости и относительно простым экспериментальным процедурам13,15. Эти модели…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить животноводческий центр ТУМ и центр визуализации отделения нуклеарной медицины Klinikum rechts der Isar за отличную техническую поддержку. Это исследование было поддержано Немецким онкологическим консорциумом (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 и S01) для D.S., Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 и 2017.091.2) для D.S. и Европейским исследовательским советом (ERC CoG No 648521, для D.S.).
Materials
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D. Tissue-specific tumorigenesis: Context matters. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 239-253 (2017).
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
