Aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón para modelar el cáncer de páncreas
Summary
Los aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) recapitulan la biología, los fenotipos y las respuestas terapéuticas de los subtipos de enfermedades. Debido a su progresión tumoral rápida y reproducible, son ampliamente utilizados en estudios preclínicos. Aquí, mostramos prácticas comunes para generar estos modelos, inyectando cultivos singénicos murinos de PDAC en el páncreas.
Abstract
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es una enfermedad muy compleja caracterizada por un microambiente tumoral heterogéneo compuesto por un estroma diverso, células inmunitarias, vasos, nervios y componentes de la matriz extracelular. A lo largo de los años, se han desarrollado diferentes modelos de PDAC en ratones para abordar los desafíos planteados por su progresión, potencial metastásico y heterogeneidad fenotípica. Los aloinjertos ortotópicos de ratón inmunocompetentes de PDAC han demostrado ser muy prometedores debido a su progresión tumoral rápida y reproducible en comparación con los modelos de ratón modificados genéticamente. Además, combinado con su capacidad para imitar las características biológicas observadas en PDAC autóctono, los modelos de ratón de aloinjerto ortotópico basados en líneas celulares permiten experimentos in vivo a gran escala. Por lo tanto, estos modelos son ampliamente utilizados en estudios preclínicos para análisis rápidos de genotipo-fenotipo y farmacorrespuesta. El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque reproducible y robusto para inyectar con éxito cultivos primarios de células PDAC de ratón en el páncreas de ratones receptores singénicos. Además de los detalles técnicos, se da información importante que debe considerarse antes de realizar estos experimentos.
Introduction
Recientemente, PDAC se convirtió en la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en el mundo occidental1. Causa la tasa de mortalidad más alta entre todos los cánceres y una tasa de supervivencia general a 10 años de ~ 1%, que no ha cambiado durante las décadas2. Debido a la falta de progreso en el tratamiento de PDAC, se espera que esta enfermedad se convierta en la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en la próxima década3.
Los tumores PDAC son entidades complejas caracterizadas por un microambiente tumoral diverso (EMT) compuesto por un conjunto heterogéneo de componentes del estroma, vasculares, inmunes y de la matriz extracelular4. Las diferencias en la composición del EMT influyen en el pronóstico de la enfermedad y en la respuesta al tratamiento 4,5,6. De hecho, muchos estudios han demostrado que el subtipo mesenquimal basal de PDAC se asocia con un TME altamente inmunosupresor y muestra disminución de la supervivencia y falta de respuesta a las terapias 7,8,9,10,11,12. Por lo tanto, una comprensión más profunda de las diferencias en la composición de TME y cómo estas características influyen en la biología tumoral sigue siendo un factor importante para el desarrollo de terapias molecularmente precisas. Para comprender mejor la biología detrás de este complejo fenotipo e identificar estrategias terapéuticas capaces de superar la barrera que constituye el TME de PDAC, los modelos in vivo son indispensables.
Un aspecto clave para cualquier sistema modelo preclínico de cáncer es que debe imitar fenotipos humanos, recapitulando tanto la heterogeneidad genética como el medio incorporando la multitud de poblaciones estromales e inmunes que componen el TME. Por lo tanto, al elegir modelos de ratón para la investigación preclínica, se deben tener en cuenta varios aspectos. Para investigar la interacción tumor-inmune, se pueden inyectar líneas celulares de cáncer histocompatibles en ratones inmunocompetentes singénicos. En la mayoría de los casos, estos se inyectan por vía subcutánea en el flanco del ratón, lo que permite un fácil monitoreo del tumor por palpación o inspección visual. Sin embargo, los modelos resultantes no imitan el crecimiento de las células tumorales en su órgano de origen. Por lo tanto, los trasplantes ortotópicos se convirtieron en el estándar de oro para los modelos de aloinjertos.
Los aloinjertos ortotópicos de ratón tienen varias ventajas: son rentables, se pueden generar con un procedimiento relativamente simple y dan como resultado modelos con composición molecular conocida, así como una progresión tumoral y un fenotipo reproducibles y predecibles. De hecho, mientras que los modelos de xenoinjertos derivados del paciente representan el comportamiento de las células PDAC humanas con precisión, la necesidad de implantación en ratones inmunodeficientes para evitar el rechazo del injerto limita el análisis de las interacciones tumor-inmune y tumor-estroma, lo que permite a los investigadores capturar solo una imagen parcial de la complejidad de estos tumores. Los aloinjertos ortotópicos singénicos de PDAC tienen una ventaja en este sentido también en comparación con los modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM). Los GEMM recapitulan con precisión la tumorigénesis del PDAC humano y la heterogeneidad observada en los pacientes con PDAC. Sin embargo, debido a estas características, los tumores GEMM pueden mostrar una alta varianza en su composición genética, progresión tumoral, agresividad, diferenciación histológica y composición de TME. Si bien esto puede ser una ventaja en ciertos estudios, limita los estudios de genotipo a fenotipo y la investigación enfocada de los fenotipos PDAC13. Por lo tanto, los aloinjertos ortotópicos de ratón constituyen una buena compensación y modelo para realizar estudios tumor-huésped y tratamiento in vivo. Este documento describe un protocolo para experimentos de trasplante ortotópico de células PDAC murinas en el páncreas de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón representan un modelo robusto para estudios preclínicos debido a su costo-efectividad, reproducibilidad y procedimientos experimentales relativamente simples13,15. Estos modelos no solo permiten el estudio de las interacciones tumor-huésped, sino que también garantizan la preservación de la heterogeneidad genética de los tumores de los que se originan cuando se utilizan cultivos primarios de células de rat?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a la instalación de animales TUM y a la instalación central de imágenes del Departamento de Medicina Nuclear, Klinikum rechts der Isar, por su excelente apoyo técnico. Este estudio fue apoyado por el Consorcio Alemán del Cáncer (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 y S01) a D.S., Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 y 2017.091.2) a D.S., y el Consejo Europeo de Investigación (ERC CoG No. 648521, a D.S.).
Materials
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
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