Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts om alvleesklierkanker te modelleren
Summary
Syngenetische muis orthotopische allografts van pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) recapituleren de biologie, fenotypen en therapeutische reacties van ziektesubtypen. Vanwege hun snelle, reproduceerbare tumorprogressie worden ze veel gebruikt in preklinische studies. Hier tonen we gemeenschappelijke praktijken om deze modellen te genereren, waarbij syngenetische murine PDAC-culturen in de alvleesklier worden geïnjecteerd.
Abstract
Pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) is een zeer complexe ziekte die wordt gekenmerkt door een heterogene tumormicro-omgeving die bestaat uit een divers stroma, immuuncellen, bloedvaten, zenuwen en extracellulaire matrixcomponenten. In de loop der jaren zijn verschillende muismodellen van PDAC ontwikkeld om de uitdagingen aan te pakken die worden gesteld door de progressie, het metastatische potentieel en de fenotypische heterogeniteit. Immunocompetente muis orthotopische allografts van PDAC zijn veelbelovend gebleken vanwege hun snelle en reproduceerbare tumorprogressie in vergelijking met genetisch gemanipuleerde muismodellen. Bovendien, in combinatie met hun vermogen om de biologische kenmerken na te bootsen die worden waargenomen in autochtone PDAC, maken op cellijn gebaseerde orthotopische allograftmuismodellen grootschalige in vivo experimenten mogelijk. Deze modellen worden dus veel gebruikt in preklinische studies voor snelle genotype-fenotype- en geneesmiddelresponsanalyses. Het doel van dit protocol is om een reproduceerbare en robuuste aanpak te bieden voor het succesvol injecteren van primaire muis PDAC-celculturen in de pancreas van syngenetische ontvangende muizen. Naast de technische details wordt belangrijke informatie gegeven die moet worden overwogen voordat deze experimenten worden uitgevoerd.
Introduction
Onlangs werd PDAC de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen in de westerse wereld1. Het veroorzaakt het hoogste sterftecijfer van alle kankers en een 10-jaars totale overlevingskans van ~ 1%, die al tientallen jaren niet is veranderd2. Vanwege het gebrek aan vooruitgang in de PDAC-behandeling, wordt verwacht dat deze ziekte de tweede belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen zal worden in het volgende decennium3.
PDAC-tumoren zijn complexe entiteiten die worden gekenmerkt door een diverse tumormicro-omgeving (TME) die bestaat uit een heterogene samenstelling van stroma-, vasculaire, immuun- en extracellulaire matrixcomponenten4. Verschillen in de samenstelling van de TME beïnvloeden de ziekteprognose en respons op therapie 4,5,6. Inderdaad, veel studies hebben aangetoond dat het basale, mesenchymale subtype van PDAC geassocieerd is met een zeer immunosuppressieve TME en een verminderde overleving en gebrek aan respons op therapieënvertoont 7,8,9,10,11,12. Daarom blijft een dieper begrip van de verschillen in TME-samenstelling en hoe deze kenmerken de tumorbiologie beïnvloeden een belangrijke factor voor de ontwikkeling van moleculair nauwkeurige therapieën. Om de biologie achter dit complexe fenotype beter te begrijpen en therapeutische strategieën te identificeren die in staat zijn om de barrière te overwinnen die de TME van PDAC vormt, zijn in vivo modellen onmisbaar.
Een belangrijk aspect voor elk preklinisch kankermodelsysteem is dat het menselijke fenotypen moet nabootsen, waarbij zowel de genetische heterogeniteit als het milieu de veelheid aan stromale en immuunpopulaties die deel uitmaken van de TME wordt samengevat. Daarom moet bij het kiezen van muismodellen voor preklinisch onderzoek rekening worden gehouden met verschillende aspecten. Om de tumor-immuuninteractie te onderzoeken, kunnen histocompatibele kankercellijnen worden geïnjecteerd in syngeneïsche immunocompetente muizen. In de meeste gevallen worden deze subcutaan geïnjecteerd in de flank van de muis, waardoor eenvoudige tumormonitoring door palpatie of visuele inspectie mogelijk is. De resulterende modellen bootsen echter niet de groei van tumorcellen in hun orgaan van oorsprong na. Daarom werden orthotopische transplantaties de gouden standaard voor allograftmodellen.
Orthotopische allografts bij muizen hebben verschillende voordelen: ze zijn kosteneffectief, kunnen worden gegenereerd met een relatief eenvoudige procedure en resulteren in modellen met bekende moleculaire make-up, evenals een reproduceerbare en voorspelbare tumorprogressie en fenotype. Inderdaad, terwijl patiënt-afgeleide xenograftmodellen het gedrag van menselijke PDAC-cellen nauwkeurig weergeven, beperkt de behoefte aan implantatie in immunodeficiënte muizen om transplantaatafstoting te voorkomen de analyse van de tumor-immuun- en tumor-stroma-interacties, waardoor onderzoekers slechts een gedeeltelijk beeld van de complexiteit van deze tumoren kunnen vastleggen. Syngenetische orthotopische allografts van PDAC hebben in dit opzicht ook een voordeel ten opzichte van genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM’s). GEMM’s vatten de menselijke PDAC-tumorigenese en de heterogeniteit waargenomen bij PDAC-patiënten nauwkeurig samen. Vanwege deze kenmerken kunnen GEMM-tumoren echter een hoge variantie vertonen in hun genetische samenstelling, tumorprogressie, agressiviteit, histologische differentiatie en TME-samenstelling. Hoewel dit een voordeel kan zijn in bepaalde studies, beperkt het genotype-naar-fenotypestudies en het gerichte onderzoek van PDAC-fenotypen13. Daarom vormen orthotopische allografts van muizen een goede afweging en model om tumor-gastheer- en behandelingsstudies in vivo uit te voeren. Dit artikel schetst een protocol voor orthotopische transplantatie-experimenten van muizen PDAC-cellen in de muispancreas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syngenetische orthotopische allografts bij muizen vormen een robuust model voor preklinische studies vanwege hun kosteneffectiviteit, reproduceerbaarheid en relatief eenvoudige experimentele procedures13,15. Deze modellen maken niet alleen de studie van tumor-gastheerinteracties mogelijk, maar garanderen ook het behoud van de genetische heterogeniteit van de tumoren waaruit ze afkomstig zijn wanneer primaire muiscelculturen voor het experiment worden gebruikt.</p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de TUM-dierenfaciliteit en de beeldvormingskernfaciliteit van de afdeling Nucleaire Geneeskunde, Klinikum rechts der Isar, bedanken voor de uitstekende technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door het German Cancer Consortium (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 en S01) aan D.S., de Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 en 2017.091.2) aan D.S., en de European Research Council (ERC CoG No. 648521, to D.S.).
Materials
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D. Tissue-specific tumorigenesis: Context matters. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 239-253 (2017).
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
