Allotrapianti ortotopici singeneici di topo per modello di cancro del pancreas
Summary
Gli allotrapianti ortotopici singeneici di topo dell’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) ricapitolano la biologia, i fenotipi e le risposte terapeutiche dei sottotipi di malattia. Grazie alla loro progressione tumorale rapida e riproducibile, sono ampiamente utilizzati negli studi preclinici. Qui, mostriamo pratiche comuni per generare questi modelli, iniettando colture di PDAC murino singeneico nel pancreas.
Abstract
L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una malattia molto complessa caratterizzata da un microambiente tumorale eterogeneo costituito da uno stroma diversificato, cellule immunitarie, vasi, nervi e componenti della matrice extracellulare. Nel corso degli anni, sono stati sviluppati diversi modelli murini di PDAC per affrontare le sfide poste dalla sua progressione, dal potenziale metastatico e dall’eterogeneità fenotipica. Gli allotrapianti ortotopici immunocompetenti di PDAC hanno mostrato buone promesse grazie alla loro progressione tumorale rapida e riproducibile rispetto ai modelli murini geneticamente modificati. Inoltre, combinati con la loro capacità di imitare le caratteristiche biologiche osservate nel PDAC autoctono, i modelli murini di allotrapianto ortotopico basati su linee cellulari consentono esperimenti in vivo su larga scala. Pertanto, questi modelli sono ampiamente utilizzati negli studi preclinici per analisi rapide genotipo-fenotipo e farmaco-risposta. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un approccio riproducibile e robusto per iniettare con successo colture cellulari primarie di PDAC di topo nel pancreas di topi riceventi singeneici. Oltre ai dettagli tecnici, vengono fornite informazioni importanti che devono essere considerate prima di eseguire questi esperimenti.
Introduction
Recentemente, il PDAC è diventato la terza causa di decessi correlati al cancro nel mondo occidentale1. Provoca il più alto tasso di mortalità tra tutti i tumori e un tasso di sopravvivenza globale a 10 anni di ~ 1%, che non è cambiato per decenni2. A causa della mancanza di progressi nel trattamento del PDAC, questa malattia dovrebbe diventare la seconda causa di decessi correlati al cancro entro il prossimo decennio3.
I tumori PDAC sono entità complesse caratterizzate da un diverso microambiente tumorale (TME) composto da un assemblaggio eterogeneo di componenti della matrice stroma, vascolare, immunitaria ed extracellulare4. Le differenze nella composizione della TME influenzano la prognosi della malattia e la risposta alla terapia 4,5,6. Infatti, molti studi hanno dimostrato che il sottotipo basale mesenchimale del PDAC è associato ad una TME altamente immunosoppressiva e mostra una diminuzione della sopravvivenza e della mancanza di risposta alle terapie 7,8,9,10,11,12. Pertanto, una comprensione più profonda delle differenze nella composizione della TME e di come queste caratteristiche influenzano la biologia dei tumori rimane un fattore importante per lo sviluppo di terapie molecolarmente precise. Per comprendere meglio la biologia alla base di questo complesso fenotipo e identificare strategie terapeutiche in grado di superare la barriera che la TME del PDAC costituisce, i modelli in vivo sono indispensabili.
Un aspetto chiave per qualsiasi sistema modello preclinico di cancro è che dovrebbe imitare i fenotipi umani, ricapitolando sia l’eterogeneità genetica che l’ambiente che incorpora la moltitudine di popolazioni stromali e immunitarie che compongono la TME. Pertanto, quando si scelgono modelli murini per la ricerca preclinica, devono essere presi in considerazione diversi aspetti. Per studiare l’interazione tumore-immune, linee cellulari tumorali istocompatibili possono essere iniettate in topi immunocompetenti singeneici. Nella maggior parte dei casi, questi vengono iniettati per via sottocutanea nel fianco del topo, consentendo un facile monitoraggio del tumore mediante palpazione o ispezione visiva. Tuttavia, i modelli risultanti non imitano la crescita delle cellule tumorali nel loro organo di origine. Pertanto, i trapianti ortotopici sono diventati il gold standard per i modelli di allotrapianto.
Gli allotrapianti ortotopici di topo hanno diversi vantaggi: sono economici, possono essere generati con una procedura relativamente semplice e si traducono in modelli con composizione molecolare nota, nonché una progressione e un fenotipo del tumore riproducibili e prevedibili. Infatti, mentre i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente rappresentano accuratamente il comportamento delle cellule PDAC umane, la necessità di impianto in topi immunodeficienti per evitare il rigetto del trapianto limita l’analisi delle interazioni tumore-immune e tumore-stroma, consentendo ai ricercatori di catturare solo un’immagine parziale della complessità di questi tumori. Gli allotrapianti ortotopici singeneici di PDAC hanno un vantaggio in questo senso anche rispetto ai modelli murini geneticamente modificati (GEMM). I GEMM ricapitolano accuratamente la tumorigenesi PDAC umana e l’eterogeneità osservata nei pazienti PDAC. Tuttavia, a causa di queste caratteristiche, i tumori GEMM possono mostrare un’elevata varianza nel loro corredo genetico, progressione tumorale, aggressività, differenziazione istologica e composizione TME. Mentre questo può essere un vantaggio in alcuni studi, limita gli studi genotipo-fenotipo e l’indagine mirata dei fenotipi PDAC13. Pertanto, gli allotrapianti ortotopici di topo costituiscono un buon compromesso e modello per eseguire studi sull’ospite tumorale e sul trattamento in vivo. Questo documento delinea un protocollo per esperimenti di trapianto ortotopico di cellule PDAC murine nel pancreas del topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli allotrapianti ortotopici singeneici di topo rappresentano un modello robusto per gli studi preclinici grazie al loro rapporto costo-efficacia, riproducibilità e procedure sperimentali relativamente semplici13,15. Questi modelli non solo consentono lo studio delle interazioni tumore-ospite, ma garantiscono anche la conservazione dell’eterogeneità genetica dei tumori da cui provengono quando le colture primarie di cellule di topo vengono utilizzate per l’espe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la struttura per animali TUM e la struttura principale di imaging del Dipartimento di Medicina Nucleare, Klinikum rechts der Isar, per l’eccellente supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dal German Cancer Consortium (DKTK), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, dall’SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 e S01) al DS, dalla Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 e 2017.091.2) al DS e dal Consiglio europeo della ricerca (ERC CoG n. 648521, al DS).
Materials
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
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