Technische Anwendungen von Mikroelektrodenarray- und Patch-Clamp-Aufnahmen an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten
Summary
Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als vielversprechendes In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der Kontraktilität und Elektrophysiologie von hiPSC-CMs.
Abstract
Arzneimittelinduzierte Kardiotoxizität ist die Hauptursache für Arzneimittelabnutzung und Rückzug vom Markt. Daher ist die Verwendung geeigneter präklinischer kardialer Sicherheitsbewertungsmodelle ein kritischer Schritt bei der Arzneimittelentwicklung. Derzeit hängt die kardiale Sicherheitsbewertung noch stark von Tierversuchen ab. Tiermodelle sind jedoch aufgrund artspezifischer Unterschiede, insbesondere in Bezug auf kardiale elektrophysiologische Eigenschaften, von einer schlechten translationalen Spezifität für den Menschen geplagt. Daher besteht ein dringender Bedarf, ein zuverlässiges, effizientes und humanbasiertes Modell für die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung zu entwickeln. Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als unschätzbares In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. hiPSC-CMs können von Personen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen und verschiedenen Krankheitszuständen erhalten werden, was sie zu einem idealen Surrogat macht, um die medikamenteninduzierte Kardiotoxizität individuell zu beurteilen. Daher müssen Methoden zur umfassenden Untersuchung der funktionellen Merkmale von hiPSC-CMs festgelegt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir verschiedene funktionelle Assays, die an hiPSC-CMs bewertet werden können, einschließlich der Messung der Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und der Kalziumhandhabung. Insgesamt hat die Einbeziehung von hiPSC-CMs in die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung das Potenzial, die Arzneimittelentwicklung zu revolutionieren.
Introduction
Die Entwicklung von Medikamenten ist ein langer und teurer Prozess. Eine Studie über neue therapeutische Medikamente, die zwischen 2009 und 2018 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassen wurden, berichtete, dass die geschätzten Mediankosten für aktivierte Forschung und klinische Studien 985 Millionen US-Dollar pro Produktbetrugen 1. Arzneimittelinduzierte Kardiotoxizität ist die Hauptursache für Arzneimittelabnutzung und Rückzug vom Markt2. Insbesondere wird Kardiotoxizität unter mehreren Klassen von Therapeutika berichtet3. Daher ist die kardiale Sicherheitsbewertung eine entscheidende Komponente während des Arzneimittelentwicklungsprozesses. Das derzeitige Paradigma für die kardiale Sicherheitsbewertung ist immer noch stark von Tiermodellen abhängig. Speziesunterschiede von der Verwendung von Tiermodellen werden jedoch zunehmend als Hauptursache für ungenaue Vorhersagen für medikamenteninduzierte Kardiotoxizität bei menschlichen Patienten erkannt4. Zum Beispiel unterscheidet sich die Morphologie des kardialen Aktionspotentials zwischen Mensch und Maus aufgrund der Beiträge verschiedener repolarisierender Ströme erheblich5. Darüber hinaus wurden differentielle Isoformen von kardialem Myosin und zirkulären RNAs, die die Herzphysiologie beeinflussen können, bei Spezies 6,7 gut dokumentiert. Um diese Lücken zu schließen, ist es unerlässlich, ein zuverlässiges, effizientes und humanbasiertes Modell für die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung zu etablieren.
Die bahnbrechende Erfindung der Technologie für induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) hat beispiellose Plattformen für das Arzneimittelscreening und die Krankheitsmodellierung geschaffen. In den letzten zehn Jahren haben sich Methoden zur Erzeugung humaninduzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteter Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) gut etabliert 8,9. hiPSC-CMs haben großes Interesse an ihren potenziellen Anwendungen in der Krankheitsmodellierung, im medikamenteninduzierten Kardiotoxizitätsscreening und in der Präzisionsmedizin geweckt. Zum Beispiel wurden hiPSC-CMs verwendet, um die pathologischen Phänotypen von Herzerkrankungen zu modellieren, die durch genetische Vererbung verursacht werden, wie das Long-QT-Syndrom10, die hypertrophe Kardiomyopathie 11,12 und die dilatative Kardiomyopathie13,14,15. Folglich wurden wichtige Signalwege identifiziert, die an der Pathogenese von Herzerkrankungen beteiligt sind und Aufschluss über mögliche therapeutische Strategien für eine wirksame Behandlung geben können. Darüber hinaus wurden hiPSC-CMs verwendet, um medikamenteninduzierte Kardiotoxizität im Zusammenhang mit Antikrebsmitteln, einschließlich Doxorubicin, Trastuzumab und Tyrosinkinase-Inhibitoren, zu screenen16,17,18; Strategien zur Milderung der daraus resultierenden Kardiotoxizität werden derzeit untersucht. Schließlich ermöglicht die in hiPSC-CMs zurückgehaltene genetische Information das Screening und die Vorhersage der medikamenteninduzierten Kardiotoxizität sowohl auf individueller als auch auf Bevölkerungsebene19,20. Insgesamt haben sich hiPSC-CMs als unschätzbares Werkzeug für die personalisierte Vorhersage der kardialen Sicherheit erwiesen.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Methoden zur umfassenden und effizienten Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von hiPSC-CMs zu etablieren, die für die Anwendung von hiPSC-CMs für die Krankheitsmodellierung, das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Präzisionsmedizin von großer Bedeutung sind. Hier beschreiben wir eine Reihe von funktionellen Assays zur Beurteilung der funktionellen Eigenschaften von hiPSC-CMs, einschließlich der Messung der Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und der Handhabung von Kalzium (Ca2+) (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die humane iPSC-Technologie hat sich zu einer leistungsstarken Plattform für die Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening entwickelt. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der hiPSC-CM-Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und des Ca2+-Transienten. Dieses Protokoll bietet eine umfassende Charakterisierung der hiPSC-CM-Kontraktilität und Elektrophysiologie. Diese funktionellen Assays wurden in mehreren Publikationen unserer Gruppe 12,13,18,24,25,26,27 an…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Blake Wu für das Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 und NASA NNX16A069A (JCW) und AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP) unterstützt.
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
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