التطبيقات التقنية لمصفوفة الأقطاب الدقيقة وتسجيلات المشبك التصحيحي على الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان
Summary
ظهرت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-CMs) التي يسببها الإنسان كنموذج واعد في المختبر لفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ونمذجة الأمراض. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول لقياس الانقباض والفيزيولوجيا الكهربية ل hiPSC-CMs.
Abstract
السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي السبب الرئيسي لاستنزاف المخدرات والانسحاب من السوق. لذلك ، يعد استخدام نماذج تقييم سلامة القلب قبل السريرية المناسبة خطوة حاسمة أثناء تطوير الدواء. حاليا ، لا يزال تقييم سلامة القلب يعتمد بشكل كبير على الدراسات التي أجريت على الحيوانات. ومع ذلك ، تعاني النماذج الحيوانية من ضعف الخصوصية الانتقالية للبشر بسبب الاختلافات الخاصة بالأنواع ، خاصة من حيث الخصائص الكهروفسيولوجية القلبية. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لتطوير نموذج موثوق به وفعال وقائم على الإنسان لتقييم سلامة القلب قبل السريرية. ظهرت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC-CMs) كنموذج لا يقدر بثمن في المختبر لفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ونمذجة الأمراض. يمكن الحصول على hiPSC-CMs من الأفراد ذوي الخلفيات الوراثية المتنوعة والحالات المرضية المختلفة ، مما يجعلها بديلا مثاليا لتقييم سمية القلب الناجمة عن الأدوية بشكل فردي. لذلك ، يجب وضع منهجيات للتحقيق الشامل في الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل العديد من الفحوصات الوظيفية التي يمكن تقييمها على hiPSC-CMs ، بما في ذلك قياس الانقباض ، والإمكانات الميدانية ، وإمكانات العمل ، ومعالجة الكالسيوم. بشكل عام ، فإن دمج hiPSC-CMs في تقييم سلامة القلب قبل السريرية لديه القدرة على إحداث ثورة في تطوير الأدوية.
Introduction
تطوير الأدوية عملية طويلة ومكلفة. أفادت دراسة للعقاقير العلاجية الجديدة التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) بين عامي 2009 و 2018 أن متوسط التكلفة المقدرة للبحوث والتجارب السريرية المرسملة كان 985 مليون دولار لكل منتج1. السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي السبب الرئيسي لاستنزاف المخدرات والانسحاب من السوق2. والجدير بالذكر أنه تم الإبلاغ عن سمية القلب بين فئات متعددة من الأدوية العلاجية3. لذلك ، يعد تقييم سلامة القلب مكونا حاسما أثناء عملية تطوير الدواء. لا يزال النموذج الحالي لتقييم سلامة القلب يعتمد اعتمادا كبيرا على النماذج الحيوانية. ومع ذلك ، يتم التعرف بشكل متزايد على الاختلافات بين الأنواع من استخدام النماذج الحيوانية كسبب رئيسي للتنبؤات غير الدقيقة لسمية القلب الناجمة عن المخدرات في المرضى من البشر4. على سبيل المثال ، يختلف مورفولوجيا إمكانات عمل القلب اختلافا كبيرا بين البشر والفئران بسبب المساهمات من تيارات إعادة الاستقطاب المختلفة5. بالإضافة إلى ذلك ، تم توثيق الأشكال التفاضلية للميوسين القلبي والحمض النووي الريبي الدائري الذي يمكن أن يؤثر على فسيولوجيا القلب بشكل جيد بين الأنواع 6,7. لسد هذه الفجوات ، من الضروري إنشاء نموذج موثوق وفعال وقائم على الإنسان لتقييم سلامة القلب قبل السريرية.
أدى الاختراع الرائد لتكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) إلى إنشاء منصات غير مسبوقة لفحص الأدوية ونمذجة الأمراض. على مدى العقد الماضي ، أصبحت طرق توليد الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-CMs) التي يسببها الإنسانراسخة 8,9. اجتذبت hiPSC-CMs اهتماما كبيرا بتطبيقاتها المحتملة في نمذجة الأمراض ، وفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ، والطب الدقيق. على سبيل المثال ، تم استخدام hiPSC-CMs لنمذجة الأنماط الظاهرية المرضية لأمراض القلب الناجمة عن الوراثة الوراثية ، مثل متلازمة QT الطويلة 10 ، واعتلال عضلة القلب الضخامي11,12 ، واعتلال عضلة القلب الموسع13,14,15. ونتيجة لذلك، تم تحديد مسارات الإشارات الرئيسية المتورطة في التسبب في أمراض القلب، والتي يمكن أن تلقي الضوء على الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للعلاج الفعال. علاوة على ذلك ، تم استخدام hiPSC-CMs لفحص سمية القلب الناجمة عن الأدوية المرتبطة بالعوامل المضادة للسرطان ، بما في ذلك مثبطات دوكسوروبيسين وتراستوزوماب والتيروزين كيناز16،17،18 ؛ ويجري التحقيق في استراتيجيات للتخفيف من سمية القلب الناتجة عن ذلك. وأخيرا ، فإن المعلومات الجينية المحتفظ بها في hiPSC-CMs تسمح بفحص والتنبؤ بسمية القلب الناجمة عن المخدرات على كل من المستوى الفردي والسكاني19,20. بشكل جماعي ، أثبتت hiPSC-CMs أنها أداة لا تقدر بثمن للتنبؤ بسلامة القلب الشخصية.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو وضع منهجيات للتحقيق بشكل شامل وفعال في الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs ، والتي لها أهمية كبيرة في تطبيق hiPSC-CMs نحو نمذجة الأمراض ، وفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ، والطب الدقيق. هنا ، نقوم بتفصيل مجموعة من الفحوصات الوظيفية لتقييم الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs ، بما في ذلك قياس الانقباض ، والإمكانات الميدانية ، وإمكانات العمل ، ومعالجة الكالسيوم (Ca2 +) (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
برزت تقنية iPSC البشرية كمنصة قوية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لقياس انقباض hiPSC-CM ، وإمكانات المجال ، وإمكانات العمل ، و Ca2 + العابر. يوفر هذا البروتوكول توصيفا شاملا لانقباض hiPSC-CM والفيزيولوجيا الكهربية. تم تطبيق هذه الفحوصات الوظيفية في منشورات متعددة من مجم?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بليك وو على التدقيق اللغوي للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL113006 و R01 HL141371 و R01 HL163680 و R01 HL141851 و U01FD005978 و NASA NNX16A069A (JCW) و AHA PostPhD Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
Riferimenti
- Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
- Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
- Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
- Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
- Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
- Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
- Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
- Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
- Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
- Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
- Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
- Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
- Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
- Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
- Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
- Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
- Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
- Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
- Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
- Milligan, C. J., Möller, C., Gamper, N. . Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).
