Tekniske anvendelser af mikroelektrodearray- og patch-klemmeoptagelser på humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter
Summary
Humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) er opstået som en lovende in vitro-model til lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og sygdomsmodellering. Her beskriver vi en protokol til måling af kontraktilitet og elektrofysiologi af hiPSC-CM’er.
Abstract
Lægemiddelinduceret kardiotoksicitet er den førende årsag til nedslidning af lægemidler og tilbagetrækning fra markedet. Derfor er brug af passende prækliniske modeller til vurdering af hjertesikkerhed et kritisk skridt under lægemiddeludvikling. I øjeblikket er hjertesikkerhedsvurdering stadig meget afhængig af dyreforsøg. Dyremodeller er imidlertid plaget af dårlig translationel specificitet for mennesker på grund af artsspecifikke forskelle, især med hensyn til hjerteelektrofysiologiske egenskaber. Der er således et presserende behov for at udvikle en pålidelig, effektiv og menneskebaseret model til præklinisk hjertesikkerhedsvurdering. Humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) er opstået som en uvurderlig in vitro-model til lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og sygdomsmodellering. hiPSC-CM’er kan fås fra personer med forskellig genetisk baggrund og forskellige syge tilstande, hvilket gør dem til en ideel surrogat til at vurdere lægemiddelinduceret kardiotoksicitet individuelt. Derfor er det nødvendigt at etablere metoder til omfattende undersøgelse af hiPSC-CM’ers funktionelle egenskaber. I denne protokol beskriver vi forskellige funktionelle assays, der kan vurderes på hiPSC-CM’er, herunder måling af kontraktilitet, feltpotentiale, handlingspotentiale og calciumhåndtering. Samlet set har inkorporeringen af hiPSC-CM’er i præklinisk hjertesikkerhedsvurdering potentialet til at revolutionere lægemiddeludviklingen.
Introduction
Lægemiddeludvikling er en lang og dyr proces. En undersøgelse af nye terapeutiske lægemidler godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) mellem 2009 og 2018 rapporterede, at de anslåede medianomkostninger ved kapitaliseret forskning og kliniske forsøg var $ 985 millioner pr. Produkt1. Lægemiddelinduceret kardiotoksicitet er den hyppigste årsag til nedslidning af lægemidler og tilbagetrækning fra markedet2. Især rapporteres kardiotoksicitet blandt flere klasser af terapeutiske lægemidler3. Derfor er vurdering af hjertesikkerhed en afgørende komponent under lægemiddeludviklingsprocessen. Det nuværende paradigme for vurdering af hjertesikkerhed er stadig meget afhængigt af dyremodeller. Artsforskelle fra brugen af dyremodeller anerkendes imidlertid i stigende grad som en primær årsag til unøjagtige forudsigelser for lægemiddelinduceret kardiotoksicitet hos humane patienter4. For eksempel adskiller morfologien af hjertehandlingspotentiale sig væsentligt mellem mennesker og mus på grund af bidragene fra forskellige repolariserende strømme5. Derudover er differentielle isoformer af hjertemyosin og cirkulære RNA’er, der kan påvirke hjertefysiologien, veldokumenterede blandt art 6,7. For at bygge bro over disse huller er det bydende nødvendigt at etablere en pålidelig, effektiv og menneskebaseret model for præklinisk hjertesikkerhedsvurdering.
Den banebrydende opfindelse af induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har genereret hidtil usete lægemiddelscreenings- og sygdomsmodelleringsplatforme. I løbet af det sidste årti er metoder til at generere menneskeskabte pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) blevet veletablerede 8,9. hiPSC-CM’er har tiltrukket stor interesse for deres potentielle anvendelser inden for sygdomsmodellering, lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og præcisionsmedicin. For eksempel er hiPSC-CM’er blevet brugt til at modellere de patologiske fænotyper af hjertesygdomme forårsaget af genetisk arv, såsom langt QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 og dilateret kardiomyopati13,14,15. Derfor er der identificeret vigtige signalveje, der er impliceret i patogenesen af hjertesygdomme, som kan kaste lys over potentielle terapeutiske strategier for effektiv behandling. Desuden er hiPSC-CM’er blevet brugt til at screene lægemiddelinduceret kardiotoksicitet forbundet med kræftmidler, herunder doxorubicin, trastuzumab og tyrosinkinasehæmmere16,17,18; Strategier til at afbøde den resulterende kardiotoksicitet er ved at blive undersøgt. Endelig giver den genetiske information, der opbevares i hiPSC-CM’er, mulighed for screening og forudsigelse af lægemiddelinduceret kardiotoksicitet på både individ- og befolkningsniveau19,20. Samlet set har hiPSC-CM’er vist sig at være et uvurderligt værktøj til personlig forudsigelse af hjertesikkerhed.
Det overordnede mål med denne protokol er at etablere metoder til omfattende og effektivt at undersøge de funktionelle egenskaber ved hiPSC-CM’er, som er af stor betydning for anvendelse af hiPSC-CM’er til sygdomsmodellering, lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og præcisionsmedicin. Her beskriver vi en række funktionelle assays for at vurdere de funktionelle egenskaber ved hiPSC-CM’er, herunder måling af kontraktilitet, feltpotentiale, handlingspotentiale og calcium (Ca2+) håndtering (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Human iPSC-teknologi er opstået som en stærk platform for sygdomsmodellering og lægemiddelscreening. Her beskriver vi en detaljeret protokol til måling af hiPSC-CM-kontraktilitet, feltpotentiale, handlingspotentiale og Ca2+ forbigående. Denne protokol giver en omfattende karakterisering af hiPSC-CM kontraktilitet og elektrofysiologi. Disse funktionelle assays er blevet anvendt i flere publikationer fra vores gruppe 12,13,18,24,25,26,27.…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Blake Wu for korrekturlæsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 og NASA NNX16A069A (JCW) og AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
Riferimenti
- Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
- Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
- Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
- Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
- Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
- Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
- Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
- Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
- Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
- Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
- Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
- Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
- Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
- Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
- Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
- Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
- Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
- Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
- Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
- Milligan, C. J., Möller, C., Gamper, N. . Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).
