Tekniske anvendelser av mikroelektrodematrise og patchklemmeopptak på humaninduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter
Summary
Menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) har dukket opp som en lovende in vitro-modell for legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og sykdomsmodellering. Her beskriver vi en protokoll for måling av kontraktilitet og elektrofysiologi av hiPSC-CM.
Abstract
Narkotika-indusert kardiotoksisitet er den ledende årsaken til narkotika slitasje og tilbaketrekking fra markedet. Bruk av egnede prekliniske evalueringsmodeller for hjertesikkerhet er derfor et kritisk skritt under legemiddelutvikling. For tiden er hjertesikkerhetsvurdering fortsatt svært avhengig av dyreforsøk. Dyremodeller er imidlertid plaget av dårlig translasjonsspesifisitet for mennesker på grunn av artsspesifikke forskjeller, spesielt når det gjelder hjerteelektrofysiologiske egenskaper. Det er derfor et presserende behov for å utvikle en pålitelig, effektiv og menneskebasert modell for preklinisk hjertesikkerhetsvurdering. Menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) har dukket opp som en uvurderlig in vitro-modell for legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og sykdomsmodellering. hiPSC-CM kan fås fra personer med ulik genetisk bakgrunn og ulike syke tilstander, noe som gjør dem til et ideelt surrogat for å vurdere legemiddelindusert kardiotoksisitet individuelt. Derfor må metoder for å undersøke de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM etableres. I denne protokollen beskriver vi ulike funksjonelle analyser som kan vurderes på hiPSC-CMs, inkludert måling av kontraktilitet, feltpotensial, handlingspotensial og kalsiumhåndtering. Samlet sett har inkorporering av hiPSC-CM i preklinisk hjertesikkerhetsvurdering potensial til å revolusjonere legemiddelutvikling.
Introduction
Narkotikautvikling er en lang og kostbar prosess. En studie av nye terapeutiske legemidler godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) mellom 2009 og 2018 rapporterte at den estimerte mediankostnaden for kapitalisert forskning og kliniske studier var $ 985 millioner per produkt1. Legemiddelindusert kardiotoksisitet er den viktigste årsaken til legemiddelslitasje og tilbaketrekning fra markedet2. Spesielt er kardiotoksisitet rapportert blant flere klasser av terapeutiske legemidler3. Derfor er hjertesikkerhetsvurdering en avgjørende komponent i legemiddelutviklingsprosessen. Det nåværende paradigmet for hjertesikkerhetsvurdering er fortsatt svært avhengig av dyremodeller. Imidlertid blir artsforskjeller fra bruk av dyremodeller i økende grad anerkjent som en primær årsak til unøyaktige spådommer for legemiddelindusert kardiotoksisitet hos mennesker4. For eksempel varierer morfologien til hjertets handlingspotensial vesentlig mellom mennesker og mus på grunn av bidragene fra forskjellige repolariserende strømmer5. I tillegg er differensialisoformer av hjertemyosin og sirkulære RNA som kan påvirke hjertefysiologien godt dokumentert blant art 6,7. For å bygge bro over disse hullene er det viktig å etablere en pålitelig, effektiv og menneskebasert modell for preklinisk hjertesikkerhetsvurdering.
Den banebrytende oppfinnelsen av indusert pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har generert enestående narkotikascreening og sykdomsmodelleringsplattformer. I løpet av det siste tiåret har metoder for å generere menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) blitt godt etablert 8,9. hiPSC-CMs har tiltrukket seg stor interesse for deres potensielle anvendelser i sykdomsmodellering, legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og presisjonsmedisin. For eksempel har hiPSC-CM blitt brukt til å modellere de patologiske fenotypene av hjertesykdommer forårsaket av genetisk arv, for eksempel lang QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 og dilatert kardiomyopati13,14,15. Følgelig har viktige signalveier involvert i patogenesen av hjertesykdommer blitt identifisert, noe som kan kaste lys over potensielle terapeutiske strategier for effektiv behandling. Videre har hiPSC-CM blitt brukt til å screene legemiddelindusert kardiotoksisitet assosiert med kreftmidler, inkludert doksorubicin, trastuzumab og tyrosinkinasehemmere16,17,18; Strategier for å redusere den resulterende kardiotoksisiteten er under utredning. Endelig tillater den genetiske informasjonen som beholdes i hiPSC-CMs screening og prediksjon av legemiddelindusert kardiotoksisitet på både individ- og populasjonsnivå19,20. Samlet har hiPSC-CMs vist seg å være et uvurderlig verktøy for personlig hjertesikkerhetsprediksjon.
Det overordnede målet med denne protokollen er å etablere metoder for omfattende og effektivt å undersøke de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM, som er av stor betydning for å anvende hiPSC-CM mot sykdomsmodellering, legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og presisjonsmedisin. Her beskriver vi en rekke funksjonelle analyser for å vurdere de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CMs, inkludert måling av kontraktilitet, feltpotensial, handlingspotensial og kalsiumhåndtering (Ca2+) (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Human iPSC-teknologi har dukket opp som en kraftig plattform for sykdomsmodellering og narkotikascreening. Her beskriver vi en detaljert protokoll for måling av hiPSC-CM kontraktilitet, feltpotensial, aksjonspotensial og Ca2+ transient. Denne protokollen gir en omfattende karakterisering av hiPSC-CM kontraktilitet og elektrofysiologi. Disse funksjonelle analysene har blitt brukt i flere publikasjoner fra vår gruppe 12,13,18,24,25,26,27.<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Blake Wu for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978, og NASA NNX16A069A (JCW), og AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
Riferimenti
- Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
- Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
- Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
- Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
- Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
- Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
- Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
- Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
- Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
- Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
- Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
- Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
- Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
- Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
- Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
- Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
- Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
- Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
- Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
- Milligan, C. J., Möller, C., Gamper, N. . Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).
