JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Технические применения микроэлектродных массивов и записей зажимов пластырей на кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Published: August 04, 2022
doi:
10.3791/64265
, , , ,
1Stanford Cardiovascular Institute,Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine,Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology,Stanford University School of Medicine

Summary

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали многообещающей моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными препаратами, и моделирования заболеваний. Здесь мы подробно описываем протокол измерения сократимости и электрофизиологии hiPSC-CM.

Abstract

Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и вывода лекарств с рынка. Поэтому использование соответствующих доклинических моделей оценки сердечной безопасности является критическим шагом при разработке лекарств. В настоящее время оценка сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от исследований на животных. Тем не менее, животные модели страдают от плохой трансляционной специфичности для людей из-за видовых различий, особенно с точки зрения электрофизиологических характеристик сердца. Таким образом, существует острая необходимость в разработке надежной, эффективной и основанной на человеке модели доклинической оценки сердечной безопасности. Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали бесценной моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными средствами, и моделирования заболеваний. hiPSC-CMs могут быть получены от людей с различным генетическим фоном и различными заболеваниями, что делает их идеальным суррогатом для оценки лекарственно-индуцированной кардиотоксичности индивидуально. Поэтому необходимо разработать методологии всестороннего изучения функциональных характеристик hiPSC-CM. В этом протоколе мы подробно описываем различные функциональные анализы, которые могут быть оценены на hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция. В целом, включение hiPSC-CM в доклиническую оценку сердечной безопасности может революционизировать разработку лекарств.

Introduction

Разработка лекарств является длительным и дорогостоящим процессом. Исследование новых терапевтических препаратов, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в период с 2009 по 2018 год, показало, что средняя стоимость капитализированных исследований и клинических испытаний составила 985 миллионов долларов США за продукт1. Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и изъятия лекарств с рынка2. Примечательно, что кардиотоксичность сообщается среди нескольких классов терапевтических препаратов3. Поэтому оценка сердечной безопасности является важным компонентом в процессе разработки препарата. Нынешняя парадигма оценки сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от животных моделей. Тем не менее, видовые различия от использования животных моделей все чаще признаются в качестве основной причины неточных прогнозов лекарственно-индуцированной кардиотоксичности у пациентов с человеческими заболеваниями4. Например, морфология потенциала сердечного действия существенно различается между людьми и мышами из-за вклада различных реполяризующих токов5. Кроме того, дифференциальные изоформы сердечного миозина и круговых РНК, которые могут влиять на физиологию сердца, были хорошо задокументированы среди видов 6,7. Чтобы восполнить эти пробелы, необходимо создать надежную, эффективную и основанную на человеке модель доклинической оценки сердечной безопасности.

Новаторское изобретение технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) создало беспрецедентные платформы для скрининга лекарств и моделирования заболеваний. За последнее десятилетие методы получения индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали хорошо известными 8,9. hiPSC-CMs привлекли большой интерес к их потенциальному применению в моделировании заболеваний, скрининге кардиотоксичности, вызванном лекарственными средствами, и прецизионной медицине. Например, hiPSC-CM были использованы для моделирования патологических фенотипов сердечных заболеваний, вызванных генетическим наследованием, таких как синдром удлиненного интервала QT10, гипертрофическая кардиомиопатия 11,12 и дилатационная кардиомиопатия 13,14,15. Следовательно, были выявлены ключевые сигнальные пути, участвующие в патогенезе сердечных заболеваний, которые могут пролить свет на потенциальные терапевтические стратегии эффективного лечения. Кроме того, hiPSC-CMs использовались для скрининга лекарственно-индуцированной кардиотоксичности, связанной с противоопухолевыми агентами, включая доксорубицин, трастузумаб и ингибиторы тирозинкиназы 16,17,18; изучаются стратегии смягчения результирующей кардиотоксичности. Наконец, генетическая информация, хранящаяся в hiPSC-CM, позволяет проводить скрининг и прогнозировать медикаментозную кардиотоксичность как на индивидуальном, так и на популяционном уровнях19,20. В совокупности hiPSC-CM оказались бесценным инструментом для персонализированного прогнозирования сердечной безопасности.

Общей целью этого протокола является разработка методологий для всестороннего и эффективного исследования функциональных характеристик hiPSC-CMs, которые имеют большое значение для применения hiPSC-CM для моделирования заболеваний, скрининга кардиотоксичности, вызванного лекарственными средствами, и прецизионной медицины. Здесь мы подробно описываем массив функциональных анализов для оценки функциональных свойств hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция (Ca2+) (рисунок 1).

Protocol

1. Подготовка носителей и решений Подготовьте поддерживающую среду hiPSC-CM, смешав бутылку объемом 10 мл добавки 50x B27 и 500 мл среды RPMI 1640. Храните среду при температуре 4 °C и используйте ее в течение месяца. Уравновешивайте среднюю температуру до комнатной температуры (RT) перед …

Representative Results

Этот протокол описывает, как измерить движение сжатия, потенциал поля, потенциал действия и переходный процесс Ca2+ hiPSC-CM. Принципиальная схема, включающая ферментативное пищеварение, посев клеток, поддержание и проведение функционального анализа, показана на рисунке 1</…

Discussion

Технология iPSC человека стала мощной платформой для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Здесь мы описываем подробный протокол для измерения сократимости hiPSC-CM, потенциала поля, потенциала действия и переходного периода Ca2+. Этот протокол обеспечивает комплексную хара…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Блейка Ву за корректуру рукописи. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 и NASA NNX16A069A (JCW), а также AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

Materials

35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C., Gamper, N. . Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).

Tags

Human IPSC-derived CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentPre-clinical EvaluationMicroelectrode ArrayPatch ClampDisease ModelingDrug-induced Cardiotoxicity ScreeningPrecision MedicineCell CultureExtracellular MatrixCell SeedingSpontaneous Beating
check_url/it/64265?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image