생쥐의 소음성 난청에 대한 수정된 실험 조건 및 청력 기능 및 외부 유모 세포 손상 평가
Summary
여기서는 소음성 난청(NIHL)의 마우스 모델에 대한 프로토콜을 제시합니다. NIHL을 유도하기 위해 골판지 플라스틱, 쥐덫 케이지 및 스피커를 사용하여 새롭고 간단한 장치를 개발했습니다. 청각 뇌간 반응과 면역형광 영상을 각각 사용하여 청력 기능과 외부 유모 세포 손상을 평가했습니다.
Abstract
소음성 난청(NIHL)의 동물 모델은 병리학자, 치료사, 약리학자 및 청력 연구자가 NIHL의 메커니즘을 철저히 이해하고 이후에 해당 치료 전략을 최적화하는 데 유용합니다. 이 연구는 NIHL의 마우스 모델을 개발하기 위한 개선된 프로토콜을 만드는 것을 목표로 합니다. 수컷 C57BL/6J 마우스가 이 연구에 사용되었습니다. 마취되지 않은 마우스는 연속 5일 동안 하루 6시간 동안 지속적으로 시끄러운 소음(1kHz 및 6kHz, 115-125dB SPL-A에서 동시에 표시됨)에 노출되었습니다. 청각 기능은 청각 뇌간 반응(ABR)을 사용하여 소음 노출 후 1일 및 1주일 후에 평가되었습니다. ABR 측정 후, 마우스를 희생시키고, 면역형광 염색을 위해 그들의 코르티(Corti) 기관을 수집하였다. 청각 뇌간 반응(ABR) 측정에서 소음 노출 후 1일 후에 상당한 청력 손실이 관찰되었습니다. 1주일 후, 실험용 마우스의 청력 역치는 ~80dB SPL로 감소했으며, 이는 여전히 대조군 마우스(~40dB SPL)보다 훨씬 높은 수준이었습니다. 면역형광 영상의 결과로부터, 외모세포(OHC)가 손상된 것으로 나타났다. 요약하면, 우리는 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하여 NIHL 모델을 만들었습니다. 순음 노이즈를 생성하고 전달하기 위한 새롭고 간단한 장치가 개발되어 채택되었습니다. 청력 역치의 정량적 측정과 OHC 손상의 형태학적 확인은 모두 적용된 소음이 예상되는 청력 손실을 성공적으로 유도했음을 입증했습니다.
Introduction
전 세계적으로 약 13억 명의 사람들이 소음 노출로 인한 청력 손실로 고통받고 있습니다1. 본 연구에서는 소음성 난청(NIHL)을 유도하고 확인하기 위한 명확한 단계별 프로세스를 확립하는 것을 목표로 했습니다. NIHL은 유모 세포(HC) 및 나선형 신경절 뉴런(SGN)의 변성/파괴, HC 입체섬모의 손상 및/또는 달팽이관 내부 HC와 SGN 사이의 시냅스 손실로 인해 발생합니다. 이러한 이상은 NIHL 외에도 이명 및 언어 인식 장애(특히 복잡한 음향 환경에서)를 유발할 수 있습니다. 사회적, 심리적, 인지적 기능은 이러한 생리적 결함에 의해 순차적으로 영향을 받을 수 있다 2,3,4,5,6.
마우스를 기반으로 한 NIHL 관련 전임상 연구에서 가장 인기 있는 마우스 균주는 CBA/CaJ 2,3,6,7 및 C57BL/6 4,5,8입니다. 또한 수컷 3,4,7 마우스는 에스트로겐이 청력에 보호 효과가 있기 때문에 암컷 마우스보다 더 일반적으로 사용됩니다. 따라서 본 연구에서는 수컷 마우스만을 사용하였다9. 문헌을 참조한 후 적용된 노이즈의 주파수로 1kHz와 6kHz를 선택했습니다. 적용된 노이즈의 강도는 115dB SPL-A(케이지 주변) 내지 125dB SPL-A(케이지 중앙)였습니다. 실험 마우스를 하루에 6시간 동안 연속적으로 소음에 노출시킨 후, 연속 5일 동안, 청력 역치의 최적 증가는 실험 마우스에서 NIHL의 최적 정도가 생성되었음을 나타냅니다. 동물을 다루고, 실험 설정을 구축하고, 소음을 유도하는 작업은 모두 제공된 프로토콜에 단계별로 명확하게 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NIHL은 청력 역치의 시간적 이동을 나타내는 일시적 NIHL과 영구적인 청력 역치 이동을 특징으로 하는 영구 NIHL의 두 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. 6일째 (소음 노출 후 1일)에 관찰한 청력 손실은 이 두 가지 유형의 조합으로 여겨집니다. 이 경우 청력 역치는 청력 손실의 시간적 구성 요소로 인해 시간이 지남에 따라 점진적인 회복을 보여줍니다. 우리의 예비 실험 연구에서, 동일한 설정…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
대만 정부 과학기술부(MOST)의 보조금(MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3)과 Mackay Medical College(MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03)의 교내 연구 보조금에 감사드립니다.
Materials
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
Riferimenti
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