Condições experimentais modificadas para perda auditiva induzida por ruído em camundongos e avaliação da função auditiva e lesão das células ciliadas externas
Summary
Apresentamos um protocolo para um modelo de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) em camundongos. Para induzir a PAIR, desenvolvemos um dispositivo novo e simples usando plástico corrugado, uma gaiola armadilha para ratos e um alto-falante. O potencial evocado auditivo de tronco encefálico e a imagem de imunofluorescência foram empregados para avaliar a função auditiva e o dano às células ciliadas externas, respectivamente.
Abstract
Um modelo animal de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) é útil para patologistas, terapeutas, farmacologistas e pesquisadores da audição entenderem completamente o mecanismo da PAIR e, posteriormente, otimizarem as estratégias de tratamento correspondentes. Este estudo tem como objetivo criar um protocolo aprimorado para o desenvolvimento de um modelo de PAIR em camundongos. Camundongos C57BL/6J machos foram utilizados neste estudo. Camundongos não anestesiados foram expostos a ruídos intensos (1 e 6 kHz, apresentados simultaneamente a 115-125 dB NPS-A) continuamente por 6 h por dia durante 5 dias consecutivos. A função auditiva foi avaliada 1 dia e 1 semana após a exposição ao ruído, por meio do potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE). Após a medida do PEATE, os camundongos foram sacrificados e seus órgãos de Corti foram coletados para coloração por imunofluorescência. A partir das medidas do potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE), observou-se perda auditiva significativa 1 dia após a exposição ao ruído. Após 1 semana, os limiares auditivos dos camundongos experimentais diminuíram para ~80 dB NPS, que ainda era um nível significativamente maior do que os camundongos controles (~40 dB NPS). A partir dos resultados da imagem de imunofluorescência, as células ciliadas externas (CCE) mostraram-se danificadas. Em resumo, criamos um modelo de PAIR usando camundongos machos C57BL/6J. Um novo e simples dispositivo para gerar e fornecer ruído de tom puro foi desenvolvido e então empregado. As medidas quantitativas dos limiares auditivos e a confirmação morfológica do dano das CCE demonstraram que o ruído aplicado induziu com sucesso uma perda auditiva esperada.
Introduction
Cerca de 1,3 bilhão de pessoas no mundo sofrem de perda auditiva devido à exposição ao ruído1. O objetivo deste estudo foi estabelecer um passo a passo claro para a indução e confirmação da perda auditiva induzida por ruído (PAIR). A PAIR resulta de degeneração/destruição das células ciliadas (HCs) e neurônios do gânglio espiral (SGNs), dano nos estereocílios do HC e/ou perda de sinapses entre os HCs internos da cóclea e os SGNs. Tais anormalidades também podem causar zumbido e prejuízo na percepção da fala (principalmente em ambientes acústicos complexos), além da PAIR. As funções sociais, psicológicas e cognitivas podem ser afetadas sequencialmente por essas deficiências fisiológicas 2,3,4,5,6.
Em estudos pré-clínicos relacionados à PAIR baseados em camundongos, as linhagens de camundongos mais populares são CBA/CaJ 2,3,6,7 e C57BL/6 4,5,8. Além disso, os camundongosmachos 3,4,7 são mais comumente utilizados do que as fêmeas, pois o estrógeno tem um efeito protetor sobre a audição. Portanto, neste estudo foram utilizados apenas camundongos machos9. Após consulta à literatura, optou-se por 1 kHz e 6 kHz como as frequências do ruído aplicado. A intensidade do ruído aplicado foi de 115 dB NPS-A (ao redor da gaiola) a 125 dB NPS-A (no centro da gaiola). Após a exposição contínua dos camundongos experimentais ao ruído por 6 h por dia, durante 5 dias consecutivos, um ótimo aumento no limiar auditivo indicou que uma ótima extensão de PAIR foi gerada nos camundongos experimentais. As operações para o manuseio dos animais, construção do arranjo experimental e indução de ruído estão claramente descritas passo a passo no protocolo fornecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
A PAIR pode ser dividida em dois tipos: a PAIR temporária, que mostra um desvio temporal do limiar auditivo, e a PAIR permanente, que é caracterizada por uma mudança permanente do limiar auditivo. Acredita-se que a perda auditiva observada no6º dia (1 dia após a exposição ao ruído) seja uma combinação destes dois tipos. Neste caso, o limiar auditivo apresentaria uma recuperação gradual ao longo do tempo devido ao componente temporal da perda auditiva. Em nossos estudos experimentais preliminares, o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos as bolsas do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST) do Governo de Taiwan (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3), e bolsas de pesquisa intramuros do Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
Materials
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
Riferimenti
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