Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Эффективное редактирование генома мышей с помощью ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ ЗИГОТ CRISPR

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

Здесь мы описываем простую технику, предназначенную для эффективной генерации генетически модифицированных мышей, под названием CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Этот метод обеспечивает редактирование реагентов путем электропорации в эмбрионы с эффективностью, приближающейся к 100%. Этот протокол эффективен для точечных мутаций, небольших геномных вставок и делеций у эмбрионов млекопитающих.

Abstract

Благодаря исключительной эффективности, точности и простоте система CRISPR/Cas9 значительно улучшила редактирование генома в клеточных культурах и лабораторных экспериментах на животных. При создании животных моделей электропорация зигот обеспечивает более высокую эффективность, простоту, стоимость и пропускную способность в качестве альтернативы методу микроинъекции золотого стандарта. Электропорация также более мягкая, с более высокой жизнеспособностью и надежно доставляет рибонуклеопротеины Cas9 / однонаправленной РНК (sgRNA) (RNP) в зиготы распространенных лабораторных штаммов мышей (например, C57BL / 6J и C57BL / 6N), что приближается к 100% эффективности доставки. Этот метод позволяет вставлять / делеционировать (indels) мутации, точечные мутации, делецию целых генов или экзонов и небольшие вставки в диапазоне 100-200 bp для вставки LoxP или коротких тегов, таких как FLAG, HA или V5. Несмотря на постоянное улучшение, здесь мы представляем текущее состояние CRISPR-EZ в протоколе, который включает в себя производство sgRNA посредством транскрипции in vitro , обработки эмбрионов, сборки RNP, электропорации и генотипирования предимплантационных эмбрионов. Исследователь уровня выпускника с минимальным опытом манипулирования эмбрионами может получить генетически отредактированные эмбрионы менее чем за 1 неделю, используя этот протокол. Здесь мы предлагаем простой, недорогой, эффективный, высокопроизводительный метод, который можно использовать с эмбрионами мышей.

Introduction

Редактирование генома у живых мышей было значительно упрощено и стало доступным и более доступным с момента появления редактирования CRISPR 1,2,3. Первоначальные попытки редактирования животных использовали микроинъекцию для доставки мРНК/сгРНК CRISPR Cas9 в эмбрионы пронуклеарной стадии 4,5,6. Хотя микроинъекция довольно эффективна, объем практики, необходимый для ее полного освоения, может не подходить для стажеров и студентов, а также требует дорогостоящего оборудования, которое скромно финансируемая лаборатория не может себе позволить. Микроинъекция обычно выполняется экспертами-техниками на трансгенных объектах с графиками и ценами на услуги, которые ограничивают скорость для многих исследователей. Более доступным подходом является электропорация, которая, как было продемонстрировано, довольно эффективна для доставки CRISPR Cas9 мРНК/сгРНК в эмбрионы пронуклеарной стадии7. Дальнейшие усовершенствования в стратегиях редактирования и доставки генома CRISPR показали, что предварительно собранные RNP, уже связанные с sgRNAs, могут быть эффективным средством снижения мозаицизма8.

Обоснование разработки и использования этого протокола заключалось в том, чтобы обойти многие ограничения и препятствия, связанные с микроинъекцией. Как следует из названия, простой, внутренний и экономически эффективный метод, который мог бы быстро определить, стоит ли использовать непроверенные конструкции сгРНК во время эксперимента с микроинъекцией, был бы очень удобным этапом контроля качества первого прохода (рисунок 1). Хотя этот метод не может заменить микроинъекцию для более сложных стратегий, таких как введение длинных последовательностей донорской ДНК для результатов, основанных на рекомбинации, он идеально подходит для менее сложных стратегий, таких как небольшие делеции или вставки и маркировка генов. Этот метод подходит для исследователей с базовыми навыками манипулирования эмбрионами, которые имеют простые потребности в редактировании, хотели бы проверить свою гипотезу в сроки развития до имплантации или предпочитают тестировать sgRNAs в эмбрионах, прежде чем назначать встречу со специалистом по микроинъекции. Здесь реагенты редактирования временно доставляются в эмбрионы пронуклеарной стадии в виде РНК Cas9/sgRNA посредством электропорации (серия электрических импульсов) для максимизации эффективности при одновременном снижении мозаицизма8. Используя метод генотипирования эмбрионов, результаты редактирования доступны примерно через 1 неделю9, что снижает потребность в различных применениях микроинъекций при значительно сниженных затратах.

Эффективность этого метода достигает пика на стадии пронуклеарного эмбриона, когда эмбрион еще не слил материнскую и отцовскую пронуклеи или не вошел в S-фазу (рисунок 2). Суперовуляция используется для максимизации количества зигот, но производит как пронуклеарные зиготы, так и неоплодотворенные яйцеклетки. Здоровые зиготы также могут быть предварительно отобраны перед электропорацией для повышения общей эффективности. Поскольку другие протоколы электропорации эффективно редактируют зиготы без необходимости включать аналогичную стадию 7,10,11,12,13,14,15, факультативным шагом этого протокола является небольшая эрозия зоны пеллюцидов (ZP). ZP представляет собой слой гликопротеинов, который способствует связыванию сперматозоидов, акросомному ответу и оплодотворению, окружающему эмбрионы пронуклеарной стадии. По нашему опыту, мы обнаружили, что мягкая эрозия ZP на кислотной основе обеспечивает надежную электропорацию Cas9 RNP с лишь незначительным влиянием на жизнеспособность.

Мы наблюдали скорость доставки RNP до 100% эффективности посредством электропорации в штаммах мышей, которые обычно используются в таких исследованиях, как C57BL / 6J и C57BL / 6N 9,16. Независимые группы также разработали процедуры на основе электропорации с эффективностью более или соответствующей микроинъекцией 11,12,13,14,15,17, с протоколами электропорации, хорошо функционирующими у крыс 18,19, свиней 20,21,22 и коров 23 Поэтому мы предлагаем читателям сравнить протоколы, чтобы найти условия, которые наилучшим образом соответствуют их экспериментальным потребностям и потребностям в оборудовании. Система, описанная здесь, использует общие материалы и оборудование, требующие только базовых навыков манипулирования эмбрионами. Этот метод эффективен для целого ряда стратегий редактирования, что делает этот метод широко доступным для исследовательского сообщества.

Проектирование идеальных малых направляющих РНК (sgRNAs) имеет важное значение для эффективного редактирования. Мы рекомендуем проводить скрининг двух-трех стратегий сгРНК на целевой участок непосредственно у эмбрионов мышей, особенно если требуется генерация линии мыши. После разработки рекомендуются методы без клонирования, такие как транскрипция in vitro (IVT) для получения высококачественных sgRNAs3. RNP и sgRNAs смешивают с 30-50 обработанными эмбрионами пронуклеарной стадии и подвергают воздействию серии электрических импульсов, чтобы сначала временно проникнуть в ZP и клеточную мембрану, с последующими импульсами, чтобы держать поры открытыми и электрофоризировать RNP через зиготу24. После оптимизации мы обнаружили, что шесть импульсов 3 мс при 30 В для объемных эмбрионов (~ 50) были оптимальными для эффективности и жизнеспособности редактирования, обеспечивая высокоэффективную доставку РНП Cas9 / sgRNA 9,16,25. События редактирования в отдельных морулах мыши могут быть подтверждены с использованием различных стратегий проверки, общих для редактирования CRISPR, таких как полиморфизм длины фрагмента ограничения (RFLP), переваривание эндонуклеазы T7 и секвенирование Сэнгера интересующей области26.

Текущий метод наиболее подходит для простых схем редактирования (рисунок 3), таких как вставка/удаление (indels), удаление размером с экзон порядка 500-2000 bp, а также доставка точечных мутаций и небольших вставок, таких как C- или N-концевые теги (например, FLAG, HA или V5)9,16,27. Потенциал для сложного редактирования генома, такого как большие вставки флуоресцентных меток или условных аллелей, остается неопределенным и в настоящее время находится в центре внимания предстоящих улучшений.

Этот метод легко осваивается и может быть использован для быстрого тестирования sgRNAs в культивируемых эмбрионах мышей за 1 неделю9 (рисунок 1). Представленный в данной работе шестиступенчатый протокол, который включает в себя 1) проектирование сгРНК; 2) синтез сгРНК; 3) суперовуляция и спаривание; 4) культивирование, сбор и обработка эмбрионов; 5) сборка и электропорация РНП; 6) культивирование эмбрионов и генотипирование. Информация обо всех используемых материалах предоставляется (Таблица материалов). В качестве положительного контроля реагенты для редактирования локуса тирозиназы (Тир) 9,16 были включены в Дополнительную таблицу 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы ухода за животными и их использование в рамках этого протокола соответствовали политике Закона о благополучии животных, Руководству ILAR по уходу и использованию лабораторных животных и следовали руководящим принципам AVMA по эвтаназии и Руководящим принципам и политикам Комитета по институциональному уходу и использованию животных Университета Пенсильвании (IACUC). Протокол по уходу за животными и их использованию был рассмотрен и одобрен Университетом Пенсильвании IACUC для этого проекта. В целях соблюдения и осторожности просьба запросить все необходимые разрешения до начала применения этого протокола.

1. sgRNA и опциональный дизайн донорского олиго

  1. Конструкция сгРНК
    1. Выберите кандидаты sgRNAs из любых широко используемых онлайн-алгоритмов, таких как Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 или CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Поскольку каждая платформа уникальна, пожалуйста, внимательно прочитайте инструкции пользователя, чтобы спроектировать идеальные sgRNAs. Для экспериментов in/del выберите два-три sgRNAs для тестирования. Для удаления предлагаются sgRNAs, которые обрамляют целевую область, например, две sgRNAs вверх по течению от цели и две sgRNAs ниже по течению от цели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как различные онлайн-алгоритмы sgRNA учитывают внемишенные цели, чтобы избежать дефектных конструкций sgRNA, инструмент BLAST NCBI полезен для подтверждения качества выбранных последовательностей sgRNA.
    2. Вставить 19-20 нуклеотидов (nt), определенных из предыдущей стадии (1.1.1), в переменную область олиго sgRNA (дополнительная таблица 1) и приобрести синтезированную sgRNA в качестве пользовательских олиго ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка СТРАНИЦЫ не требуется.
  2. (Необязательно) Донорская олиго-конструкция для гомологического направленного восстановления (HDR) - опосредованного нокдауна.
    1. Спроектировать соответствующий одноцепочечный олигодезоксинуклеотид (ssODN) на основе желаемого экспериментального результата (точная точечная мутация, вставка loxP, вставка малого метки и т. Д.), Сохраняя общую длину до 100-200 нт с гомологическими рукавами 50 нт или более, фланкирующими центральную область.
    2. Чтобы обеспечить более высокую эффективность выбивания, спроектируйте sgRNA, чтобы она была комплементарной к ssODN30, и замените последовательность протоспейсерного смежного мотива (PAM) бесшумной мутацией, чтобы предотвратить повторное разрезание ферментом Cas9.
    3. Закажите ssODN с помощью пользовательского параметра олиго.

2. синтез сгРНК

  1. Генерация шаблонов для транскрипции in vitro (IVT)
    1. Чтобы сгенерировать шаблон ДНК для sgRNA IVT через ПЦР, подготовьте реакцию IVT в трубке полосы ПЦР, которая не содержит РНКазы. (см. дополнительную таблицу 2).
    2. Используйте следующие условия термоциклера:
      95 °C в течение 2 мин; 30 циклов при 95 °C в течение 2 мин, 57 °C в течение 10 с и 72 °C в течение 10 с; затем 72 °C в течение 2 мин
    3. Чтобы проверить успешность реакции ПЦР по шаблону ДНК сгРНК, электрофорез 5 мкл продукта сочетают с 1 мкл 6-кратного нагрузочного красителя на 2% (масс./об.) агарозный гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер продукта составляет 127 bp. Любая оставшаяся реакция ПЦР может храниться при −20 °C до 5 месяцев.
  2. Транскрипция in vitro (IVT) sgRNA
    1. Чтобы получить сгРНК, приготовьте реакционную смесь (T7 IVT в соответствии с инструкциями производителя) в трубке ПЦР и щелкните, чтобы смешать реагенты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример настройки реакции см. в дополнительной таблице 3 . Реакция ИВТ чувствительна к загрязнению РНКазой; поэтому приложите все усилия, чтобы обеспечить среду, свободную от RNase.
    2. Чтобы реакция началась и протекала, инкубируйте реакционную смесь IVT в течение >18 ч при 37 °C либо в тепловом цикле, либо в тепловом блоке.
    3. Для разложения исходного шаблона ДНК (стадия 2.1.3) вводят 1 мкл ДНКазы I (2 единицы на реакцию) и инкубируют реакцию в течение 20 мин при комнатной температуре (RT).
    4. Чтобы способствовать связыванию РНК с шариками магнитной очистки, объедините 129 мкл 100% этанола в реакции, которая теперь составит 150 мкл.
    5. Для повторного суспендирования очистительных шариков, которые имеют свойство оседать во время хранения, вихрейте аликвоту не менее 10 с.
    6. Для очистки sgRNAs добавляют 100 мкл повторно суспендированных шариков (стадия 2.2.5) к реакции IVT (стадия 2.2.4) и осторожно перемешивают, пипетируя вверх и вниз 10x.
    7. Чтобы обеспечить связывание, дайте смеси отдохнуть при RT в течение 5 мин.
    8. Чтобы изолировать sgRNA от неинкорпорированных продуктов реакции, поместите реакцию на магнитные подставки в течение 5 мин при RT и подождите, пока не образуется небольшая гранула.
    9. Чтобы промыть sgRNAs, сначала осторожно выбросьте супернатант, а затем добавьте 200 мкл 80% этанола из гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На стадии промывки этанола 80% (об/об.) крайне важно избегать нарушения гранул при пипетке, так как это значительно снизит концентрацию сгРНК. Вместо этого аккуратно выложите в пипетку 80% этанола, чтобы гранула была погружена, и аккуратно удалите объем пипеткой.
    10. Повторите предыдущую стадию (стадия 2.2.9) и высушите гранулу на воздухе не более 5-6 мин, иначе сгРНК будет постоянно связана с шариками.
    11. Элюируют sgRNA 20 мкл воды без нуклеазы путем пипетки гранулы 10x, инкубации в течение 2 мин при (RT), а затем помещают ее обратно на магнитную подставку, чтобы отделить шарики от теперь очищенной sgRNA.
    12. Чтобы оценить качество и количество сгРНК, используйте такой инструмент, как спектрофотометр или биоанализатор. Альтернативно, на 2% агарозном геле, запускают 2 мкл сгРНК, аналогично этапу 2.1.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество подтверждается одной четкой полосой. Остальная часть сгРНК может быть использована немедленно или сохранена в условиях −80 °C.

3. Суперовуляция

  1. Чтобы обеспечить достаточное количество эмбрионов для тестирования каждой конструкции sgRNA, суперовулируют от двух до трех самок C57BL / 6J в возрасте от 3 до 5 недель, как описано ранее9. Рекомендуется электропорация 20-30 эмбрионов на сгРНК для получения достаточных результатов для подтверждения эффективности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если оплодотворение прошло успешно, ожидайте 10-20 эмбрионов на спаривание.
  2. Чтобы вызвать овуляцию, следуйте этому графику инъекций гормонов:
    1. День 1: Введите 5 МЕ гонадотропина сыворотки беременной кобылы (PMSG) (100 мкл) через внутрибрюшинную (IP) инъекцию с использованием шприца 26 G в 3-5-недельных самок мышей.
    2. День 3: После 46-48 ч инъекции PMSG ввести 5 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) (100 мкл) через инъекцию IP, чтобы вызвать овуляцию.
    3. Чтобы наладить разведение, спаривайте самок 1:1 с самцом надежного разведения сразу после инъекции ХГЧ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гормоны не деградировали и не теряли активность, выполняйте инъекции в течение 30 минут оттаивания.

4. Сбор и обработка эмбрионов

  1. Коллекция эмбрионов
    1. Чтобы усыпить самок и извлечь необходимый материал, как описано ранее31, обязательно сначала подтвердите соответствующий метод в соответствии с институциональной политикой. Например, используйте асфиксиюCO2 , вывих шейки матки и / или другие одобренные методы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, >75% самок, стимулируемых гормонами, демонстрируют копуляторные пробки, что указывает на успешное спаривание.
    2. Чтобы предотвратить затруднение сбора тканей волосками, поместите усыпленных самок на спину и распылите 70% (об/об) этанола на область живота, которая будет вскрыта хирургическим путем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента рекомендуется выполнять хирургические шаги в вентилируемой вытяжке, чтобы поддерживать асептическую среду и уменьшить вероятность загрязнения.
    3. Чтобы открыть брюшную полость и удалить яйцеводы, срежьте слой кожи / волос (подкожный) хирургическими ножницами и найдите яичники (рисунок 4), которые находятся рядом с почкой и разделяют участок жировой подушки. Яйцеводы расположены проксимально к яичникам (рисунок 4). Хирургическим путем удаляют оба яйцевода у самки и помещают их в отдельные капли 50 мкл среды M2 + BSA (4 мг / мл BSA) (рисунок 5A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции для этого раздела процедуры можно просмотреть визуально31 или следовать шагу9 с использованием ранее опубликованных протоколов.
    4. Чтобы освободить кучевые ооцитарные комплексы (CoCs), содержащие ооциты (рисунок 4), используют рассеченные щипцы для прокола ампулы яйцевода при просмотре через стереомикроскоп.
    5. Чтобы уменьшить количество мусора (кровь, жир, ткань), перенесите и объедините каждый CoC в одну каплю 50 мкл среды M2 + BSA с ручной пипеткой, установленной на 20-30 мкл, чтобы избежать переноса мусора.
  2. Удаление кучевых клеток
    1. Чтобы начать удаление кучевых клеток из зигот (рисунок 4), перенесите CoCs с как можно меньшим количеством дополнительных сред в каплю 100 мкл M2 + гиалуронидазы (рисунок 5B) и осторожно перемешайте, пипетируя CoC до тех пор, пока эмбрионы не будут заметно отделены от гораздо меньших кучевых клеток. Обязательно сведите воздействие M2 + гиалуронидазы на эмбрионы к минимуму, так как это может повлиять на жизнеспособность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно либо предварительно разогреть (37 °C), либо добавить дополнительные 50 мкл M2 + гиалуронидазы, если эмбрионы не отделяются от кучевых клеток в течение 2 минут.
    2. Чтобы разбавить гиалуронидазу и удалить рыхлые кучевые клетки из зигот, используйте пипетку, управляемую ртом, чтобы переместить зиготы в свежую каплю M2 + BSA объемом 50 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство шагов после этого момента требуют использования пипетки, управляемой ртом, если не указано иное. Хотя риск загрязнения со стороны пользователя низок, рекомендуется использовать встроенный воздушный фильтр для поддержания асептической среды. Просьба ознакомиться с ранее описанными методами подготовки и использования этого документа 9,31.
    3. Используя ротовую пипетку, пропустите эмбрионы через, по крайней мере, четыре-пять еще 50 мкл капель M2 + BSA, чтобы уменьшить количество кучевых клеток.
  3. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Разбавление зоны пеллюцида раствором кислотного тирода (АТ).
    1. Чтобы размыть пеллюцидную зону эмбриона и уменьшить дополнительные физические препятствия для доставки реагента, перенесите эмбрионы в предварительно расплавленную (37 °C) каплю раствора АТ объемом 100 мкл на пластине диаметром 60 мм (рисунок 5С). Непрерывно наблюдают за зиготами с помощью стереомикроскопа до тех пор, пока примерно 30% пеллюцидной зоны не будет эродировано9. Общая экспозиция АТ должна составлять 60-90 с. Длительное воздействие АТ может полностью растворить пеллюцидную зону и поставить под угрозу жизнеспособность эмбриона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробных инструкций и изображений этого раздела процедуры, пожалуйста, обратитесь к ранее опубликованным методам 9,16.
    2. Чтобы разбавить АТ, используйте ротовую пипетку, чтобы пропустить эмбрионы по крайней мере через четыре капли 50 мкл M2 + BSA.
    3. Чтобы определить, было ли обработано соответствующее количество эмбрионов, используйте стереомикроскоп для подсчета эмбрионов. В зависимости от количества используемых самок мышей, можно ожидать примерно 10-20 жизнеспособных зигот на самку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе эмбрионы должны быть относительно свободны от мусора, который будет препятствовать оценке количества и качества. Например, при использовании пяти самок ожидаемое число зигот, вероятно, будет между 50-100, и механический счетчик клеток будет уместен для отслеживания эмбрионов. Обычно теряется около 10-20% эмбрионов из-за неспособности оплодотворения или овуляции низкокачественных яйцеклеток. Во время следующего этапа кратковременно храните эмбрионы в 50 мкл M2+BSA в течение не более 30 мин в инкубаторе.

5. Сборка и электропорация РНП

  1. Сборка RNP
    1. Чтобы собрать комплекс RNP, используйте прилагаемые примеры таблиц для объединения соответствующих реакционных смесей на основе желаемой стратегии редактирования в буфере RNP (100 мМ HEPES pH 7,5, 750 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 50% глицерина и 100 мМ Tris(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид [TCEP] в воде без нуклеазы)
      ПРИМЕЧАНИЕ: TCEP является удобным восстановителем, но имеет короткий период полураспада в водных растворах; поэтому добавьте TCEP непосредственно перед сложной сборкой RNP.
      1. Для негомологичных соединений концов (NHEJ), опосредованных инделей, см. Дополнительную таблицу 4.
      2. Сведения о редактировании, опосредованном гомологией (HDR), приведены в Дополнительной таблице 5.
      3. Технические исключения с использованием парных sgRNAs приведены в Дополнительной таблице 6.
        1. Независимо от стратегии, объедините желаемые реагенты на РТ в ПЦР-трубку.
        2. Чтобы обеспечить образование комплекса РНП, инкубируйте смесь в течение 10 мин при 37 °C.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Комплекс RNP может храниться в RT до 1 ч.
  2. Электропорация
    1. Чтобы разбавить BSA перед электропорацией, пропустите эмбрионы через, по меньшей мере, две капли по 50 мкл восстановленной сывороточной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BSA увеличивает сопротивление во время электропорации и может повредить зиготы.
    2. Для приготовления и смешивания зигот (стадия 4.3.2) с комплексом RNP (этап 5.1.1.2) для электропорации, ротовая пипетка 25-30 эмбрионов в капельку 10 мкл восстановленной сывороточной среды, а затем используйте ручную пипетку для добавления 10 мкл комплекса RNP (стадия 5.1.1.2).
    3. Чтобы разбавить вязкий глицерин из комплекса RNP и гомогенизировать образец, перемешивают путем пипетирования 10x или до тех пор, пока смесь не перестанет проявлять признаки вязкости (вихревой рисунок) с помощью стереомикроскопа.
    4. Чтобы подготовить образец к введению в электропоратор, пипетку этой смеси 20 мкл эмбриона + RNP в электропорационную кювету 0,1 см, избегая при этом пузырьков.
    5. Чтобы доставить реагенты редактирования в зиготу, электропорируйте эмбрионы, используя квадратно-волновой протокол с такими условиями: 30 В, 4-6 импульсов, длина импульса 3 мс и интервалы импульсов 100.
    6. Чтобы извлечь зиготы из кюветы, используйте ручную пипетку, чтобы доставить 50 мкл KSOM + BSA (1 мг / мл BSA) в верхнюю часть кюветы, чтобы промыть эмбрионы, которые, возможно, осели на дно. Аккуратно выложите эту смесь на пластину толщиной 60 мм.
    7. Повторите шаг 5.2.6 по крайней мере 2x-3x и объедините каждый смыв на пластине 60 мм до тех пор, пока большинство эмбрионов не будут восстановлены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичное восстановление составляет >90% первоначально загруженных эмбрионов. Чтобы обеспечить выживание эмбриона, протестируйте инкубатор и проверьте сроки годности для всех реагентов. Эмбрионы восприимчивы к неидеальным условиям культивирования, таким как температура, уровень CO2 , влажность и pH.

6. Культивирование эмбрионов и генотипирование

  1. Культура эмбрионов
    1. Чтобы культивировать зиготы до нужной стадии, используйте ротовую пипетку для переноса 20-30 зигот в каплю KSOM + BSA в предварительно уравновешенной культуральной пластине и переместите эмбрионы в каплю (рисунок 5D). Инкубируйте пластину в течение ночи в 5% CO2, при 37 °C, с влажностью 95%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно уравновешивают, помещая подготовленную 35-миллиметровую культуральную пластину в инкубатор либо за день до этого, либо по меньшей мере за 4 ч до инкубации (рисунок 5D).
    2. Для создания идеальных условий роста перенесите только двухклеточные эмбрионы на следующий день в свежую каплю смеси KSOM+BSA с помощью стереомикроскопа и вернитесь в инкубатор. Обязательно оставьте или выбросьте мертвые или неоплодотворенные эмбрионы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы пронуклеарной стадии обычно вырастают в морулы после 72 ч культуры и бластоцисты через 84 ч.
  2. Генотипирование
    1. Чтобы разбавить компоненты среды, которые могут мешать реакции ПЦР, промыть эмбрионы морулы / бластоцисты с помощью пипетки для рта, пройдя через две капли DPBS.
    2. Чтобы загрузить отдельные эмбрионы для лизиса, перенесите отдельные эмбрионы в одну лунку 8-луночной полоски ПЦР, установив пипетку на 1 мкл, а затем добавьте 10 мкл буфера лизиса (50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl ph 8,5, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл желатина, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% Tween 20, 0,2 мг/мл протеиназы K в не нуклеазномH2O).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте протеиназу K непосредственно перед приготовлением буфера лизиса.
    3. Чтобы лизировать эмбрионы, программируют тепловой циклер до 55 °C в течение 4 ч, а затем инактивируют протеиназу K с помощью 10-минутной инкубации при 95 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Особенно для начинающих пользователей, попробуйте провести эксперимент по редактированию в локусах Tyr . Этот рабочий процесс оптимизирован и может служить положительным контролем. При необходимости хранят лизаты эмбриона при 4 °C в течение 2-3 дней или в морозильной камере до 2 недель до ПЦР-анализа. Предотвращение повторных циклов замораживания-оттаивания.
    4. Чтобы увеличить шансы на успешный анализ генотипирования, выполните вложенную стратегию ПЦР, амплифицируя немного более длинные фрагменты ДНК, которые обрамляют целевой сайт, а также области, которые будут использоваться для амплификации более точного фрагмента ДНК. Следуйте условиям , приведенным в дополнительной таблице 7.
    5. Следуйте приведенным ниже условиям теплового циклера:
      95 °C в течение 2 мин
      30+ циклов: 95 °C в течение 2 мин, 60 °C в течение 10 с и 72 °C в течение 10 с
      72 °C в течение 2 мин
    6. Чтобы подготовить второй этап стратегии вложенной ПЦР, производят разбавление первого продукта ПЦР в соотношении 1:10 (этап 6.2.5) и загружают 2 мкл этого в следующую реакцию ПЦР (с праймерами, предназначенными для нахождения внутри предыдущего ампликона).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первая реакция ПЦР должна быть разбавлена, чтобы уменьшить перенос фланкирующих праймеров во второй реакции ПЦР. Подготовьте вложенную ПЦР, выполнив действия, описанные в дополнительной таблице 8.
    7. Поместите реакцию ПЦР в термоциклер, используя следующие условия цикла:
      95 °C в течение 2 мин
      30 циклов: 95 °C в течение 2 мин, 60 °C в течение 10 с и 72 °C в течение 10 с
      72 °C в течение 2 мин
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, >90% реакций ПЦР являются успешными, когда размер ампликона составляет 500 bp или менее.
    8. (Опциональный элемент управления) Для NHEJ-опосредованных мутаций in/del с использованием Tyr в качестве положительного контроля переваривают 10 мкл вложенных продуктов ПЦР со стадии 6.2.7 путем инкубации при 37 °C в течение 4 ч с использованием 10 ЕД HinfI в реакции 20 мкл (см. Дополнительную таблицу 9). На 2% агарозном геле запустите переваренный продукт для оценки редактирования и используйте непереваренный продукт ПЦР в качестве контроля нагрузки. Запускайте гель при 135 В в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование HinfI в качестве соответствующего фермента рестрикции было выбрано из-за удобно расположенного сайта HinfI, присутствующего в целевой области sgRNA, который, по прогнозам, будет удален после успешного редактирования NHEJ. Подробный метод и результаты были ранее описаны 9,16.
    9. (Опциональный элемент управления) Для HDR-опосредованных мутаций с использованием Tyr в качестве положительного контроля переваривайте 10 мкл вложенных продуктов ПЦР со стадии 6.2.7 путем инкубации при 37 °C в течение 4 ч с использованием 10 ЕД EcoRI в реакции 20 мкл (см. Дополнительную таблицу 10). На 2% агарозном геле запустите переваренный продукт для оценки редактирования и используйте непереваренный продукт ПЦР в качестве контроля нагрузки. Запускайте гель при 135 В в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор EcoRI в качестве диагностического фермента рестрикции использует преимущества оригинальной последовательности, обнаруженной в целевой области sgRNA, где после успешного HDR естественный сайт HinfI заменяется сайтом EcoRI, и возникает мутация сдвига кадра, которая вмешивается в ген Tyr. Для анализа HDR выполните анализ NHEJ (шаг 6.2.8) и HDR (шаг 6.2.9) на каждом образце, поскольку оба исхода могут произойти и могут помочь определить мозаицизм. Подробный метод и результаты были ранее описаны 9,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот метод генерирует более 100 мкг сгРНК (20 мкл при концентрации >6000 нг/л) для эффективной сборки РНП Cas9/sgRNA. Обычный метод суперовуляции, описанный здесь, обычно производит 10-20 жизнеспособных эмбрионов на закупоренную самку. Из-за ошибок обработки и типичных потерь, связанных с манипуляциями с эмбрионами, ожидаемые 80% эмбрионов оплодотворяются, жизнеспособны и находятся в отличном состоянии после электропорации. Чтобы помочь исследователям в проведении успешного эксперимента, мы привели пример стратегии нацеливания на локус мышиного тира в качестве положительного контроля (рисунок 6), включая олигоконструкции (рисунок 6A, дополнительная таблица 1) и стратегии генотипирования как для событий NHEJ, так и для HDR (рисунок 6B) (шаг 6.2). Подробные примеры экспериментального успеха и результатов доступны 9,16.

В предыдущей попытке сравнить этот протокол с микроинъекцией, в совокупности, более 30 различных попыток редактирования с участием семи различных лабораторий для создания моделей мыши были успешными 9,16. Кроме того, этот метод был использован для исследования и сообщения о первом существенном ретротранспозоне в развитии млекопитающих27. При использовании простой стратегии, такой как доставка одной sgRNA, доставка RNP составляла до 100% включительно в мышиных штаммах C57BL/6J и C57BL/6N, при этом образование in/del происходило при 50-100% и небольших заменах на основе олиго в диапазоне от 14% до 63%9,16 (таблица 1). При разработке геномных делеций эффективность редактирования может варьироваться от 3% до 100%, где способствующие факторы включают геномное расположение, дизайн sgRNA и размер делеции (таблица 2). Например, удаления размером менее 1000 б.. более успешны, чем удаления размером более 1000 б.. 9,16.

При использовании 60 эмбрионов для электропорации этот протокол превосходит микроинъекцию с точки зрения эффективности редактирования, в результате чего получается 3-4 животных-основателя по сравнению с одним основателем из микроинъекции9. Для экспериментов с нокаутом генов на штамме мышей C57BL/6N с использованием идентичной сгРНК этот метод превзошел микроинъекцию, в результате чего в среднем четыре животных-основателя9 (таблица 2). Для небольших вставок, таких как маркировка V5 или HA, ssODN до 162 nt были успешно протестированы, и в настоящее время усилия направлены на масштабирование до 1000-2000 nt. Успех этих экспериментов во многом зависит от эффективности сгРНК, используемой для того, чтобы результаты HDR были надежными. Почти все исходы HDR являются мозаичными, но между 31% и 64% эмбрионов демонстрируют некоторые признаки вставок 9,16.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор CRISPR-EZ. Графический обзор рабочего процесса. После того, как стратегия и дизайн были разработаны, отредактированные эмбрионы могут быть сгенерированы и протестированы примерно за 1 неделю. Эта цифра была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. и Чэнь и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Идеальное время для выполнения процедуры. На диаграмме показаны соответствующие особенности и временные точки во время первого клеточного деления после оплодотворения. Чтобы реализовать этот подход, исследователям предоставляются некоторые видимые подсказки, такие как морфологические изменения, оценки времени клеточного цикла и химические маркеры, часто наблюдаемые до первого расщепления. Поскольку точные сроки оплодотворения и оплодотворения неизвестны, разумной рекомендацией было бы рассматривать час 0 как полночь. До того, как зигота войдет в S-фазу, это идеальный момент для поставки монтажного оборудования для NHEJ или HDR, что приводит к выполнению этого протокола между часами 7 утра и 11 утра. Эта цифра была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Успех стратегий редактирования. Простые стратегии, такие как одна sgRNA, приводят к in/del через восстановление NHEJ или прецизионную мутацию в сочетании с шаблоном ssODN через HDR. Восстановление NHEJ также может быть использовано для удаления с использованием нескольких sgRNAs. В целом, чем проще стратегия, тем эффективнее CRISPR-EZ без дальнейшей оптимизации. Эта цифра была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Расположение яйцевода и ампулы. После хирургического выделения репродуктивных тканей следует обезопасить область, оказав мягкое давление на жировую подушку щипцами. Жировая подушка является относительно безопасной областью для манипулирования, чтобы не повредить яичники / яйцевод. Область в пунктирном квадрате следует удалить и поместить в каплю М2 для дальнейшего рассечения. Мультяшная диаграмма показывает интересующую область с соответствующими анатомическими структурами. Эта цифра была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Предлагаемая обработка и установка культуральной пластины. Схемы, показывающие различные установки пластин, чтобы помочь исследователям в проведении как обработки эмбрионов, так и культивирования. (A) Типичная моющая пластина M2+BSA. (B) Пластина M2+гиалуронидазы для удаления кучевых клеток. (C) Дополнительная пластина раствора AT для истончения Zona. (D) Пластина KSOM+BSA для культивирования эмбрионов с наложением минерального масла, необходимого для поддержания рН, влажности и температуры. Эта цифра была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Пример генотипирования для результатов NHEJ и HDR. (A) Мультяшная диаграмма области, окружающей ген Tyr в геноме мыши. Ниже приведены подробные сведения о неотредактированной последовательности (WT), где найден естественный сайт ограничения HinfI, который находится в целевом сайте распознавания sgRNA (красный текст). Ниже приведен один из многих возможных исходов после успешного таргетинга CRISPR/Cas9, где формируется «in/del». Точный характер этого редактирования трудно предсказать, но почти наверняка нарушит работу сайта HinfI. Далее ниже приведена донорская олигопоследовательность, которая изменяет две пары оснований, чтобы превратить сайт HinfI в сайт распознавания EcoRI. (B) Репрезентативный полиморфизм длины фрагмента ограничения (RFLP) после редактирования. Показаны примеры редактирования NHEJ (вверху) и HDR (внизу). Эта цифра была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. Эта цифра была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Фенотип и жизнеспособность тир-отредактированных зигот и мышей. Эта таблица была адаптирована с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Результаты экспериментов crispr-EZ и микроинъекционной делеции. Эта таблица была адаптирована с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 1: Перечень олиго и донорских ssODN. Эта таблица была адаптирована с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Шаблон ДНК для установки реакции sgRNA. Эта таблица была адаптирована с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 3: Настройка транскрипции in vitro . Эта таблица была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 4: Комплексная установка RNP для формирования NHEJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 5: Комплексная установка RNP для формирования HDR. Эта таблица была адаптирована с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 6: Комплексная установка РНП для удаления. Эта таблица была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 7: Установка генотипирования ПЦР. Эта таблица была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 8: Установка вложенного генотипирования ПЦР. Эта таблица была изменена с разрешения Modzelewski et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 9: Настройка дайджеста ограничения HinfI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 10: Настройка дайджеста ограничения EcoRi. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь представлена простая и высокоэффективная технология редактирования генома мыши. Электропорация может быть использована для генерации модифицированных эмбрионов за 1-2 недели (рисунок 1) и может производить отредактированных мышей в течение 6 недель9. По сравнению с разработанными в то же время протоколами на основе электропорации, которые обеспечивают RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, метод, описанный здесь, концептуально аналогичен и предлагает эффективность в том же диапазоне, с незначительными различиями в разработке и параметрах реагентов. Поэтому мы предлагаем читателям сравнивать и противопоставлять на основе потребностей и доступа к оборудованию. Как следует из названия, этот протокол был разработан с учетом «средней мышиной лаборатории», с использованием только общих методов (IVT, ПЦР, гель-электрофорез), реагентов (стандартный расходный материал для эмбрионов и культур тканей) или оборудования (электропоратор и кюветы, обычно используемые для бактериальной трансфекции), которые, вероятно, доступны для большинства лабораторий, которые заинтересованы и могут собирать эмбрионы (или любезно спрашивая соседние лаборатории). Исследователи на уровне аспирантов с базовыми навыками обращения с эмбрионами могут проверять sgRNAs на эффективность или проводить эксперименты с получением данных несколько раз в течение периода времени разработки перед имплантацией без необходимости планировать с основным объектом. Однако, если желаемой целью является создание животных моделей без необходимости микроинъекции или манипуляций с эмбрионами, доступны менее навязчивые методы10,32.

Активно исследуются многие факторы, влияющие на эффективность Cas9, такие как специфичность геномной мишени, параметры последовательности sgRNA, доступность и топология генома и, особенно, тип клеток. Поэтому проектирование и тестирование sgRNAs имеет решающее значение для успеха. Этот протокол и другие независимо разработанные методы электропорации были оптимизированы для быстрой и временной доставки RNP белка / sgRNA в эмбрионы стадии зиготы, повышая эффективность при минимизации мозаицизма за счет доставки на ранней стадии развития и короткого периода полураспада RNP 7,9,10,11,12,13,14,15, 16,33,34.

Для наиболее распространенных стратегий редактирования генома и различных штаммов мышей этот метод может превзойти микроинъекции с точки зрения стоимости, эффективности, небольших вставок, мутаций in/del, делеций экзонов, вставок и точечных мутаций9. При нынешнем протоколе этот метод идеально подходит для создания мутаций и делеций in/del до 2,6 кб, что намного длиннее типичной длины белок-кодирующего экзона 170 bp35. Длительные удаления менее эффективны; однако это ограничение не является уникальным для данного протокола. Поэтому, поскольку Cas9-опосредованное редактирование улучшается и разрабатываются новые варианты белка Cas, модульный характер этого метода позволяет этим улучшениям напрямую расширять возможности нашего протокола.

Хотя этот метод может выполнять различные простые изменения, его потенциал для более крупных и сложных стратегий, таких как вставка условных аллелей или флуоресцентных тегов, в настоящее время тестируется в нашей лаборатории. Более длинные ssODN могут обеспечить жизнеспособный подход к сложному редактированию генома и показали успех в редактировании эмбрионов на основе микроинъекций36; однако более длинные ssODN дорого синтезировать и еще предстоит тщательно протестировать с электропорацией37. Использование аденоассоциированных вирусов (AAV) для введения последовательностей доноров размером до 3,3 кб также показало успех, но может быть недоступно для большинства лабораторий25. В настоящее время мы рекомендуем стандартное редактирование генома эмбриональных стволовых клеток и микроинъекцию для сложной инженерии генома мыши.

Опасения по поводу нецелевых эффектов Cas9 остаютсяна уровне 8,38,39. Инженерные вариации Cas9 могут увеличить специфичность мишени, хотя это не было полностью исследовано в исследованиях электропорации эмбрионов RNP. CRISPR-EZ может быть полезным методом для создания моделей сложных мутаций для изучения сложной генетики. В то время как микроинъекции сделали возможным одновременное редактирование нескольких локусов40, методы электропорации, подобные описанному здесь, делают это более удобным и эффективным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Соответствующих финансовых деклараций авторов нет.

Acknowledgments

A.J.M. создал оригинальную концепцию, которая привела к разработке CRISPR-EZ и произвел цифры. C.K.D. составил и адаптировал внутренние и опубликованные протоколы для этой текущей рукописи. A.J.M. поддерживается NIH (R00HD096108).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Tags

Биология развития выпуск 190
Эффективное редактирование генома мышей с помощью ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ ЗИГОТ CRISPR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J.… More

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J. Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes. J. Vis. Exp. (190), e64302, doi:10.3791/64302 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter