تم تحضير كرويات الورم 3D متعددة الخلايا مع خلايا الورم الغدي الرئوي ، والخلايا الليفية ، والوحيدات ، تليها عزل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) من هذه الكرويات. تمت مقارنة CAFs المعزولة مع الخلايا الليفية الطبيعية لتقييم صحة الميتوكوندريا من خلال دراسة إمكانات الغشاء عبر الميتوكوندريا ، وأنواع الأكسجين التفاعلية ، والأنشطة الأنزيمية.
تعد الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) من بين الخلايا اللحمية الأكثر وفرة الموجودة في البيئة المكروية للورم ، مما يسهل نمو الورم وتطوره. التعقيد داخل البيئة المكروية للورم ، بما في ذلك إفراز الورم ، والالتهاب منخفض الدرجة ، ونقص الأكسجة ، وعدم توازن الأكسدة والاختزال ، يعزز التفاعل غير المتجانس ويسمح بتحويل الخلايا الليفية المقيمة غير النشطة لتصبح CAFs نشطة. يتم تمييز CAFs الأيضية عن الخلايا الليفية العادية (NFs) لأنها أكثر نشاطا من الناحية السكرية ، وتنتج مستويات أعلى من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وتفرط في التعبير عن مصدر اللاكتات MCT-4 ، مما يؤدي إلى فتح المسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا (MPTP). هنا تم وصف طريقة لتحليل صحة الميتوكوندريا من CAFs المنشط المعزولة من كرويات الورم 3D متعددة الخلايا التي تتألف من خلايا الورم الغدي الرئوي البشري (A549) ، وحيدات الإنسان (THP-1) ، وخلايا الخلايا الليفية الرئوية البشرية (MRC5). تم تفكك الأجسام الكروية السرطانية على فترات زمنية مختلفة ومن خلال فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا ، تم عزل CAFs. تم تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا ل CAFs باستخدام صبغة JC-1 ، وإنتاج ROS بواسطة تلطيخ ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (DCFDA) 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) ، ونشاط الإنزيم في CAFs المعزولة. يوفر تحليل صحة الميتوكوندريا ل CAFs المعزولة فهما أفضل لتأثير Warburg العكسي ويمكن أيضا تطبيقه لدراسة عواقب تغيرات الميتوكوندريا CAF ، مثل التدفقات الأيضية والآليات التنظيمية المقابلة على عدم تجانس سرطان الرئة. وبالتالي ، تدعو الدراسة الحالية إلى فهم تفاعلات الورم والسدى على صحة الميتوكوندريا. سيوفر منصة للتحقق من الأدوية المرشحة الخاصة بالميتوكوندريا للتأكد من فعاليتها ضد CAFs كعلاجات محتملة في البيئة المكروية للورم ، وبالتالي منع تورط CAF في تطور سرطان الرئة.
تتكون الأورام الصلبة من مجموعات خلايا غير متجانسة تسترشد بالبيئة المكروية للورم (TME) ، ومع ذلك ، لم يتم اكتشاف أصل معظم الخلايا بعد. تعكس الخلايا اللحمية والمناعية بشكل أساسي (الخلايا الليفية ، الخلايا البطانية ، الخلايا الوحيدة ، الضامة ، الخلايا المتغصنة ، الخلايا البائية ، الخلايا التائية ، ومجموعاتها الفرعية) عدم تجانس الورم في سرطانات الرئة والثدي والكلى وغيرها من السرطانات الصلبة1،2،3. إن فهم أصل كل نوع فرعي وإمكانية التمايز العابر له حاجة ماسة لتطوير علاجات متقدمة ضد هذه السرطانات. يقدم تحليل هذه المجموعة المتنوعة من الخلايا في الخزعات البشرية نفسه أمام العديد من التحديات بسبب نوع الورم والموقع والمرحلة والحد من كمية العينة والمتغيرات الخاصة بالمريض4. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نموذج تجريبي ، وهو ليس موثوقا به فحسب ، بل يمكنه أيضا محاكاة حالة الورم في الجسم الحي ، مما يثبت أنه مثالي لدراسة الحديث المتبادل بين الورم وسدى الورم ومشاركته في الفيزيولوجيا المرضية للمرض.
تعد ثقافات الورم الكروية ثلاثية الأبعاد (3D) متعددة الخلايا (MCTS) مفيدة في نظام نموذج المختبر للأورام بسبب تشابهها مع نظيراتها الطبيعية. يمكن ل MCTS تكرار جوانب الأورام الصلبة بشكل أفضل من نماذج زراعة الخلايا 2D ، بما في ذلك بنيتها المكانية ، والاستجابات الفسيولوجية ، وإطلاق الوسطاء القابل للذوبان ، وأنماط التعبير الجيني ، وآليات مقاومة الأدوية. علاوة على ذلك ، تتمثل إحدى المزايا الرئيسية ل MCTS في أنه يمكن استخدامه لدراسة عدم تجانس الورم والبيئة المكروية للورم (TME). طريقة التعليق والإفلات هي الأداة الأكثر استخداما لتطوير وتحليل MCTS5. في هذه الطريقة ، يتم تعليق الخلايا المختلفة ذات الوسائط في شكل قطرات ، مما يسمح بنموها بطريقة مجمعة 3D متماسكة ويسهل الوصول إليها للفحص. هذه التقنية واضحة. لا يتطلب العديد من الخلايا ويلغي الحاجة إلى ركيزة متخصصة مثل الأغاروز لتطوير كروي6. ميزة إضافية لهذه الطريقة تكمن في استنساخ تقنيتها. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذه الطريقة أيضا للمشاركة في زراعة مجموعات الخلايا المختلطة ، مثل الخلايا البطانية والخلايا السرطانية ، لمحاكاة تكوين الأوعية الدموية المبكرةللورم 7.
في هذه الدراسة ، تم تحضير كرويات ورم الرئة 3D متعددة الخلايا مع خلايا الورم الغدي الرئوي ، والخلايا الليفية ، والوحيدات باستخدام طريقة القطرة المعلقة التي تحاكي البيئة المكروية لورم الرئة. ثم تم عزل السكان الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) للتحقيق في صحة الميتوكوندريا. الفكرة الرئيسية وراء تطوير هذه الكرويات هي عزل CAFs لأن الحديث المتبادل بين الخلايا في الأجسام الكروية يمكن أن يحول الخلايا الليفية إلى حالة CAF نشطة تشبه الخلايا الليفية العضلية. ثانيا ، قد تصور هذه الدراسة أيضا كيف أن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الشاذ واختلال الميتوكوندريا يدفع الخلايا الليفية الطبيعية نحو النمط الظاهري CAF الأكثر عدوانية. وقد وجد أن الخلايا الليفية المجمعة داخل كرويات الورم اكتسبت خصائص الخلايا الليفية العضلية مع زيادة نشاط أنواع الأكسجين التفاعلية وتحريض التعبير الجيني الأيضي. يسلط هذا البروتوكول الضوء على أهمية البيئة المكروية للورم في تنشيط CAF ويمكن أن يكون نموذجا ممتازا للتوليد في المختبر ودراسة خصائص النمط الظاهري CAF.
تقدم الدراسة الحالية تطور كرويات الورم متعددة الخلايا التي تضم الخلايا السرطانية ، وعدد الخلايا اللحمية (أي الخلايا الليفية) ، وعدد الخلايا المناعية (أي الخلايا الوحيدة) باستخدام طريقة إسقاط معلقة معدلة. تعد الخلايا الليفية والوحيدات / البلاعم من بين أهم المجموعات السكانية التي تشكل البي…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع جائزة التميز للمرأة الصربية ، الهند (SB / WEA-02/2017) ومشروع جائزة SERB-Early Career Research ، الهند (ECR / 2017 / 000892) إلى DP. يعترف المؤلفون ، LA و SR ب IIT Ropar و MHRD لزمالاتهم البحثية. تعترف MK ب ICMR لزمالتها البحثية.
Antibodies | |||
APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
Cell lines | |||
A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | – | |
MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | – | |
Chemicals | |||
BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
KCl | Merck | Cat# P9541 | |
MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
Plasticware | |||
MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
Equipment | |||
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
LAS X software | Leica Microsystems | ||
Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |