Bewertung der mitochondrialen Gesundheit in krebsassoziierten Fibroblasten, die aus 3D-multizellulären Lungentumor-Sphäroiden isoliert wurden
Summary
Multizelluläre 3D-Tumorsphäroide wurden mit Lungenadenokarzinomzellen, Fibroblasten und Monozyten hergestellt, gefolgt von der Isolierung von Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) aus diesen Sphäroiden. Isolierte CAFs wurden mit normalen Fibroblasten verglichen, um die mitochondriale Gesundheit zu beurteilen, indem das mitochondriale Transmembranpotential, reaktive Sauerstoffspezies und enzymatische Aktivitäten untersucht wurden.
Abstract
Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) gehören zu den am häufigsten vorkommenden Stromazellen in der Tumormikroumgebung und erleichtern das Tumorwachstum und die Progression. Die Komplexität innerhalb der Tumormikroumgebung, einschließlich Tumorsekretom, niedriggradiger Entzündung, Hypoxie und Redox-Ungleichgewicht, fördert die heterotypische Interaktion und ermöglicht die Umwandlung inaktiver residenter Fibroblasten in aktive CAFs. CAFs unterscheiden sich metabolisch von normalen Fibroblasten (NFs), da sie glykolytisch aktiver sind, höhere Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) produzieren und den Laktatexporteur MCT-4 überexprimieren, was zur Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore (MPTP) führt. Hier wurde eine Methode beschrieben, um die mitochondriale Gesundheit von aktivierten CAFs zu analysieren, die aus den multizellulären 3D-Tumorsphäroiden isoliert wurden, die aus menschlichen Lungenadenokarzinomzellen (A549), menschlichen Monozyten (THP-1) und menschlichen Lungenfibroblastenzellen (MRC5) bestehen. Tumor-Sphäroide wurden in unterschiedlichen Zeitintervallen zerfallen und durch magnetisch aktivierte Zellsortierung wurden CAFs isoliert. Das mitochondriale Membranpotenzial von CAFs wurde unter Verwendung des JC-1-Farbstoffs, der ROS-Produktion durch 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA)-Färbung und der Enzymaktivität in den isolierten CAFs bewertet. Die Analyse der mitochondrialen Gesundheit von isolierten CAFs ermöglicht ein besseres Verständnis des umgekehrten Warburg-Effekts und kann auch angewendet werden, um die Folgen von mitochondrialen Veränderungen der CAF, wie z.B. metabolische Flüsse und die entsprechenden Regulationsmechanismen auf die Heterogenität von Lungenkrebs, zu untersuchen. Daher befürwortet die vorliegende Studie ein Verständnis der Tumor-Stroma-Wechselwirkungen auf die mitochondriale Gesundheit. Es würde eine Plattform bieten, um mitochondrial-spezifische Medikamentenkandidaten auf ihre Wirksamkeit gegen CAFs als potenzielle Therapeutika in der Tumormikroumgebung zu überprüfen und so die Beteiligung von CAF an der Progression von Lungenkrebs zu verhindern.
Introduction
Solide Tumoren bestehen aus heterogenen Zellpopulationen, die von der Tumormikroumgebung (TME) gesteuert werden, jedoch ist der Ursprung der meisten Zellen noch nicht entdeckt. Hauptsächlich Stroma- und Immunzellen (Fibroblasten, Endothelzellen, Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, B-Zellen, T-Zellen und deren Untergruppen) spiegeln die Tumorheterogenität bei Lungen-, Brust-, Nieren- und anderen soliden Krebsartenwider 1,2,3. Das Verständnis des Ursprungs jedes Subtyps und seines Transdifferenzierungspotenzials ist von größter Bedeutung für die Entwicklung neuartiger Therapien gegen diese Krebsarten. Die Analyse dieser vielfältigen Zellpopulation in humanen Biopsien stellt aufgrund des Tumortyps, der Lokalisation, des Stadiums, der Begrenzung der Probenmenge und der patientenspezifischen Variabilität mehrere Herausforderungen dar4. Daher wird ein experimentelles Modell benötigt, das nicht nur zuverlässig ist, sondern auch den in vivo Tumorzustand simulieren kann und sich als ideal für die Untersuchung des Tumor-Stroma-Crosstalks und seiner Beteiligung an der Krankheitspathophysiologie erweist.
Dreidimensionale (3D) mehrzellige Tumor-Sphäroid-Kulturen (MCTS) sind aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit natürlichen Gegenstücken ein vorteilhaftes In-vitro-Modellsystem von Tumoren. MCTS kann Aspekte solider Tumore besser replizieren als 2D-Zellkulturmodelle, einschließlich ihrer räumlichen Architektur, physiologischer Reaktionen, der Freisetzung löslicher Mediatoren, Genexpressionsmuster und Arzneimittelresistenzmechanismen. Darüber hinaus besteht ein Hauptvorteil von MCTS darin, dass es zur Untersuchung der Tumorheterogenität und der Tumormikroumgebung (TME) eingesetzt werden kann. Die Hanging-Drop-Methode ist das am häufigsten eingesetzte Werkzeug zur Entwicklung und Analyse von MCTS5. Bei dieser Methode werden die verschiedenen Zellen mit Medien in Form von Tröpfchen suspendiert, was ihr Wachstum in einer kohärenten 3D-Aggregatform ermöglicht und für die Untersuchung leicht zugänglich ist. Die Technik ist einfach; Es benötigt nicht viele Zellen und eliminiert die Notwendigkeit eines spezialisierten Substrats wie Agarose für die Sphäroidentwicklung6. Ein weiterer Vorteil dieser Methode liegt in der Reproduzierbarkeit ihrer Technik. Darüber hinaus wurde diese Methode auch verwendet, um gemischte Zellpopulationen, wie Endothelzellen und Tumorzellen, zu kokulturieren, um eine frühe Tumorangiogenese zu simulieren7.
In dieser Studie wurden multizelluläre 3D-Lungentumor-Sphäroide mit Lungenadenokarzinomzellen, Fibroblasten und Monozyten unter Verwendung der Hanging-Drop-Methode hergestellt, die die Mikroumgebung des Lungentumors nachahmt. Dann wurde die krebsassoziierte Fibroblastenpopulation (CAF) isoliert, um die mitochondriale Gesundheit zu untersuchen. Die Hauptidee hinter der Entwicklung dieser Sphäroide besteht darin, die CAFs zu isolieren, da der Austausch zwischen den Zellen in Sphäroiden die Fibroblasten in einen myo-fibroblastenähnlichen aktivierten CAF-Zustand umwandeln könnte. Zweitens könnte diese Studie auch zeigen, wie anomale ROS-Produktion und mitochondriale Dysfunktion die normalen Fibroblasten in Richtung des aggressiveren CAF-Phänotyps treiben. Es wurde festgestellt, dass Fibroblasten, die in Tumorsphäroiden zusammengesetzt sind, myofibroblastische Eigenschaften mit erhöhter ROS-Aktivität und der Induktion der metabolischen Genexpression erhielten. Dieses Protokoll unterstreicht die Bedeutung der Tumormikroumgebung bei der Aktivierung von CAF und könnte ein hervorragendes Modell für die In-vitro-Generierung und Untersuchung von phänotypischen CAF-Merkmalen sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorliegende Studie stellt die Entwicklung von mehrzelligen Tumorsphäroiden vor, die Tumorzellen, Stromazellpopulation (d.h. Fibroblasten) und Immunzellpopulation (d.h. Monozyten) unter Verwendung einer modifizierten Hanging-Drop-Methode umfassen. Fibroblasten und Monozyten/Makrophagen gehören zu den wichtigsten Populationen, die die Tumormikroumgebung (TME) bilden, und ihr Vorhandensein ist oft mit einer schlechten Prognose der Patienten verbunden16. Wenn sie in der TME vorhanden sind, trans…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das SERB-Women Excellence Award Project, Indien (SB/WEA-02/2017) und das SERB-Early Career Research Award Project, Indien (ECR/2017/000892) an die DP unterstützt. Die Autoren, LA und SR, würdigen IIT Ropar und MHRD für ihre Forschungsstipendien. MK dankt ICMR für ihr Forschungsstipendium.
Materials
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | – | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | – | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
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