Оценка здоровья митохондрий в связанных с раком фибробластах, выделенных из 3D-многоклеточных сфероидов опухоли легкого
Summary
Многоклеточные 3D-сфероиды опухолей были получены с клетками аденокарциномы легких, фибробластами и моноцитами с последующим выделением связанных с раком фибробластов (CAF) из этих сфероидов. Изолированные CAF сравнивали с нормальными фибробластами для оценки здоровья митохондрий путем изучения митохондриального трансмембранного потенциала, активных форм кислорода и ферментативной активности.
Abstract
Связанные с раком фибробласты (ЦАФ) являются одними из наиболее распространенных стромальных клеток, присутствующих в микроокружении опухоли, способствуя росту и прогрессированию опухоли. Сложность в микроокружении опухоли, включая секретом опухоли, низкосортное воспаление, гипоксию и окислительно-восстановительный дисбаланс, способствует гетеротипическому взаимодействию и позволяет трансформировать неактивные резидентные фибробласты, чтобы стать активными ЦАФ. CAF метаболически отличаются от нормальных фибробластов (NF), поскольку они более гликолитически активны, производят более высокие уровни активных форм реактивного кислорода (АФК) и чрезмерно экспрессируют экспортер лактата MCT-4, что приводит к открытию митохондриальной проницаемости переходной поры (MPTP). Здесь был описан метод анализа митохондриального здоровья активированных ЦАФ, выделенных из многоклеточных 3D-сфероидов опухоли, состоящих из клеток аденокарциномы легкого человека (A549), моноцитов человека (THP-1) и клеток фибробластов легких человека (MRC5). Сфероиды опухолей распадались через разные промежутки времени и посредством магнитно-активированной сортировки клеток выделяли ЦАФ. Митохондриальный мембранный потенциал ЦАФ оценивали с использованием красителя JC-1, продукции АФК путем окрашивания 2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата (DCFDA) и активности ферментов в изолированных ЦАФ. Анализ митохондриального здоровья изолированных ЦАФ обеспечивает лучшее понимание обратного эффекта Варбурга, а также может быть применен для изучения последствий митохондриальных изменений CAF, таких как метаболические потоки и соответствующие регуляторные механизмы на гетерогенность рака легких. Таким образом, настоящее исследование выступает за понимание взаимодействия опухоли и стромы на здоровье митохондрий. Это обеспечит платформу для проверки кандидатов на митохондриальные препараты на их эффективность против ЦАФ в качестве потенциальных терапевтических средств в микроокружении опухоли, тем самым предотвращая участие CAF в прогрессировании рака легких.
Introduction
Солидные опухоли состоят из гетерогенных клеточных популяций, которые руководствуются микроокружением опухоли (TME), однако происхождение большинства клеток еще предстоит открыть. В основном стромальные и иммунные клетки (фибробласты, эндотелиальные клетки, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, В-клетки, Т-клетки и их подмножества) отражают гетерогенность опухоли при раке легких, молочной железы, почек и других солидныхраковых заболеваниях 1,2,3. Понимание происхождения каждого подтипа и их трансдифференцировочного потенциала крайне необходимо для разработки передовых методов лечения этих видов рака. Анализ этой разнообразной клеточной популяции в биопсии человека представляет собой несколько проблем из-за типа опухоли, места, стадии, ограничения количества образца и специфических для пациента вариаций4. Таким образом, необходима экспериментальная модель, которая не только надежна, но и может имитировать состояние опухоли in vivo, зарекомендовав себя как идеальная для изучения перекрестных помех опухоль-строма и ее участия в патофизиологии заболевания.
Трехмерные (3D) многоклеточные опухолевые сфероидные (MCTS) культуры являются предпочтительной модельной системой опухолей in vitro из-за их сходства с природными аналогами. MCTS может лучше воспроизводить аспекты солидных опухолей, чем модели 2D-клеточных культур, включая их пространственную архитектуру, физиологические реакции, высвобождение растворимых медиаторов, паттерны экспрессии генов и механизмы лекарственной устойчивости. Более того, одним из основных преимуществ MCTS является то, что его можно использовать для изучения гетерогенности опухоли и микроокружения опухоли (TME). Метод подвешивания является наиболее часто используемым инструментом для разработки и анализа MCTS5. В этом методе различные клетки со средой суспендируются в виде капель, что позволяет их расти в согласованном 3D-агрегате и легко доступно для исследования. Техника проста; он не требует много клеток и устраняет потребность в специализированном субстрате, таком как агароза, для развития сфероидов6. Дополнительное преимущество данного метода заключается в воспроизводимости его методики. Кроме того, этот метод также использовался для совместной культивирования смешанных клеточных популяций, таких как эндотелиальные клетки и опухолевые клетки, для моделирования раннегоопухолевого ангиогенеза 7.
В этом исследовании многоклеточные 3D-сфероиды опухолей легких были получены с клетками аденокарциномы легких, фибробластами и моноцитами с использованием метода висячей капли, который имитирует микроокружение опухоли легких. Затем популяция связанных с раком фибробластов (CAF) была выделена для изучения здоровья митохондрий. Основная идея разработки этих сфероидов заключается в том, чтобы изолировать ЦАФ, поскольку перекрестные помехи между клетками в сфероидах могут преобразовать фибробласты в мио-фибробласт-подобное активированное состояние CAF. Во-вторых, это исследование может также показать, как аберрантная выработка АФК и митохондриальная дисфункция приводят нормальные фибробласты к более агрессивному фенотипу CAF. Было обнаружено, что фибробласты, собранные внутри сфероидов опухоли, приобрели миофибробластные характеристики с повышенной активностью АФК и индукцией экспрессии метаболических генов. Этот протокол подчеркивает важность микроокружения опухоли в активации CAF и может быть отличной моделью для генерации in vitro и изучения фенотипических характеристик CAF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящее исследование вводит развитие многоклеточных сфероидов опухоли, включающих опухолевые клетки, популяцию стромальных клеток (т.е. фибробласты) и популяцию иммунных клеток (т.е. моноциты) с использованием модифицированного метода висячих капель. Фибробласты и моноциты / макроф?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана проектом SERB-Women Excellence Award Project, Индия (SB/WEA-02/2017) и проектом SERB-Early Career Research Award Project, Индия (ECR/2017/000892) для DP. Авторы, LA и SR, признают IIT Ropar и MHRD за их исследовательские стипендии. МК благодарит ICMR за ее исследовательскую стипендию.
Materials
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | – | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | – | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
Riferimenti
- Kim, N., et al. Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma. Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).
- Davidson, S., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth. Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).
- Zhang, Y., et al. Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).
- Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing patient specificity in the engineering of tumor models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Tissue Engineering. , 141-151 (2007).
- Dituri, F., et al. Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography. Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).
- Arora, L., et al. Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment. Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).
- Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers. International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).
- Zhang, Y., et al. HIF-1α is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).
- Bu, L., et al. Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).
- Whitaker-Menezes, D., et al. Evidence for a stromal-epithelial "lactate shuttle" in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts. Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).
- Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-Pérez, J. C., Marín-Hernández, A., Moreno-Sánchez, R., Rodríguez-Enríquez, S. Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).
- Bregman, A. A. . Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , (2002).
- Berry, E. A., Trumpower, B. L. Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra. Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).
- Avagliano, A., et al. Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts. BioMed Research International. , (2018).
- Lorusso, G., Rüegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).
- Sebastian, A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer. Cancers. 12 (5), 1307 (2020).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Ganguly, D., et al. Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment. Cancers. 12 (9), 2652 (2020).
- Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).
- Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling. Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).
