Teeltmethoden van Spirocheten uit Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex en Relapsing Fever Borrelia

Summary

In vitro kweek is een directe detectiemethode voor de aanwezigheid van levende bacteriën. Dit protocol beschrijft methoden voor de kweek van diverse Borrelia spirocheten, waaronder die van het Borrelia burgdorferi sensu lato-complex, recidiverende koorts Borrelia-soorten en Borrelia miyamotoi. Deze soorten zijn kieskeurig en langzaam groeiend, maar kunnen worden gekweekt.

Abstract

De Borrelia bestaat uit drie groepen soorten, die van de Lyme borreliose (LB) groep, ook bekend als B. burgdorferi sensu lato (s.l.) en onlangs opnieuw geclassificeerd in Borreliella, de relapsing fever (RF) groep Borrelia, en een derde reptielen-geassocieerde groep spirocheten. Op cultuur gebaseerde methoden blijven de gouden standaard voor de laboratoriumdetectie van bacteriële infecties voor zowel onderzoek als klinisch werk, omdat de kweek van pathogenen uit lichaamsvloeistoffen of weefsels direct replicerende pathogenen detecteert en bronmateriaal voor onderzoek biedt. Borrelia en Borreliella spirocheten zijn kieskeurig en langzaam groeiend en worden daarom niet vaak gekweekt voor klinische doeleinden; Cultuur is echter noodzakelijk voor onderzoek. Dit protocol demonstreert de methodologie en recepten die nodig zijn om LB- en RF-spirocheten met succes te kweken, inclusief alle erkende soorten uit het B. burgdorferi s.l.-complex, waaronder B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii / bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis en RFspirocheten, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis en B. miyamotoi. Het basismedium voor het kweken van LB- en RF-spirocheten is het Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II of BSK-H) medium, dat de groei van spirocheten in gevestigde culturen betrouwbaar ondersteunt. Om nieuw geïsoleerde Borrelia-isolaten te kunnen kweken uit van teken of gastheer afgeleide monsters waarbij het initiële spirocheetgetal laag is in het entmateriaal, heeft gemodificeerd Kelly-Pettenkofer (MKP) -medium de voorkeur. Dit medium ondersteunt ook de groei van B. miyamotoi. Het succes van de teelt van RF-spirocheten hangt ook kritisch af van de kwaliteit van de ingrediënten.

Introduction

Borrelia is een geslacht van spirocheetbacteriën dat drie belangrijke clades omvat: de Lyme-borreliose (LB) -groep, de relapsing fever (RF) -groep en een minder goed gekarakteriseerde groep die schijnbaar beperkt is tot reptielen. Borrelia-taxonomie is in beweging met de komst van moleculaire methodologieën die genoom- en proteoomvergelijkingen mogelijk maken, zoals geldt voor de meeste andere taxonomische groepen 1,2,3,4,5,6,7. De LB-groep (ook wel de ziekte van Lyme-groep genoemd) wordt van oudsher Borrelia burgdorferi sensu lato genoemd naar zijn best gekarakteriseerde lid Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Dit artikel gebruikt de momenteel meest gebruikte terminologie: de LB, de RF en de reptielen-geassocieerde groep, en beschrijft de kweekprotocollen voor de LB- en de RF-groepen.

Zoals te verwachten is voor een lid van de familie Spirochaetaceae, kan Borrelia de opvallend lange en dunne spiraalvorm aannemen, meestal 20-30 μm lang en 0,2-0,3 μm breed. Borrelia-cellen zijn echter zeer pleomorf en kunnen vele andere vormen aannemen in zowel cultuur als in vivo ^1,8 als gevolg van hun complexe cellulaire en genetische structuur. In zijn spirochetale vorm is de morfologie van de vlakke sinusgolf het resultaat van zijn axiale endoflagella die roteert in de periplasmatische ruimte tussen de binnenste en buitenste membranen. Deze structuur stelt de cellen in staat om zeer beweeglijk te zijn, waarbij het buitenmembraan eiwitten bevat die de cel in staat stellen om te interageren met gastheerweefsels ^9,10. De expressie van de buitenste membraaneiwitten is strak gereguleerd en beïnvloedt niet alleen de invasie van gastheerweefsel, maar ook de interactie met het immuunsysteem van de gastheer¹¹. Deze complexe genexpressie stelt de Borrelia-cellen in staat om te pendelen tussen de zeer verschillende omgevingen van gewervelde gastheren en ongewervelde vectoren. Het genoom van Borrelia is ongebruikelijk onder prokaryoten, bestaande uit een lineair in plaats van een cirkelvormig chromosoom. Naast het lineaire chromosoom bevatten Borrelia-soorten 7-21 plasmiden, sommige lineair en sommige cirkelvormig. De plasmiden herbergen de meerderheid van de genen die nodig zijn voor gastheeraanpassing en virulentie, en de circulaire plasmiden afgeleid van profagen worden verondersteld verantwoordelijk te zijn voor de meerderheid van de horizontale genstroom tussen spirochetale cellen^12,13. In overeenstemming met een rol in gastheeradaptatie, verliezen sommige, mogelijk veel of alle, leden van de Lyme-borreliosegroep plasmiden in cultuur¹⁴. De best bestudeerde “laboratorium aangepaste” stam van B. burgdorferi, B31, heeft slechts zeven van de negen plasmiden gevonden in wilde isolaten van deze soort¹⁵. Evenzo verliest B. garinii plasmiden in cultuur¹⁶. Sommige studies hebben aangetoond dat RF-soorten en B. miyamotoi plasmiden behouden wanneer ze worden gekweekt^14,17, maar recent werk toont veranderde plasmiden en infectiviteit met langdurige in vitro kweek ¹⁸.

Op cultuur gebaseerde methoden blijven de gouden standaard voor de laboratoriumdetectie van bacteriële infecties, voor zowel onderzoek als klinisch werk^14,17. De kweek van pathogenen uit lichaamsvloeistoffen of weefsels detecteert direct replicerende pathogenen en levert bronmateriaal voor onderzoek^14,17. Dit protocol demonstreert de methodologie en recepten die nodig zijn om de spirocheten van de LB-groep en RF Borrelia en B. miyamotoi met succes te kweken. Het basismedium voor het kweken van Borrelia spirocheten is het Barbour-Stoenner-Kelly medium (BSK-II of het in de handel verkrijgbare BSK-H), met of zonder antibiotica om de groei van vervuilende prokaryoten te verminderen. Dit medium werd aangepast van een medium dat oorspronkelijk werd gebruikt om RF Borrelia¹⁹ te ondersteunen, verder aangepast door Stoenner²⁰ en vervolgens door Barbour²¹. Sindsdien zijn er veel modificaties ontwikkeld, elk met effecten op de bacteriële fysiologie die de groei, infectiviteit en pathogeniciteit kunnen beïnvloeden²². Dit medium ondersteunt op betrouwbare wijze de groei van spirocheten in gevestigde culturen en is gebruikt om spirocheten te isoleren uit teken-, zoogdier- en klinische monsters²³. De meer recent ontwikkelde variatie, gemodificeerd Kelly-Pettenkofer (MKP) medium, kan zorgen voor een beter isolatiesucces, morfologie en beweeglijkheid bij het isoleren van nieuwe Borrelia-isolaten uit omgevingsmonsters, wanneer het aantal spirocheten dat aanwezig is in het monster dat beschikbaar is om de cultuur te zaaien laag^{is 23,24}. In alle gevallen is het succes van de teelt kritisch afhankelijk van het vers bereide medium en het gebruik van geschikte ingrediënten; Niet alle commerciële ingrediënten produceren een medium van hoge kwaliteit. Geënte culturen kunnen gemakkelijk worden geïncubeerd zonder te schudden in een conventionele 32-34 °C incubator in de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid resterende omgevingszuurstof. Borrelia spirocheten zijn anaëroben, maar worden in de natuur blootgesteld aan schommelingen in zuurstof- en koolstofdioxideconcentraties en reageren met veranderingen in genexpressie^26,27,28,29. Genexpressie, groei en andere metabole studies moeten dus controleren op zuurstof- en koolstofdioxideniveaus met behulp van een zuurstofgestuurde incubator of anaerobe kamer. In cultuur worden culturen wekelijks, of vaker, gecontroleerd op de aanwezigheid van spirocheten met darkfieldmicroscopie of fasecontrastmicroscopie. Kweekuitstrijkjes kunnen worden gekleurd met zilvervlekken, immunohistochemie of door het gebruik van fluorescerend gelabelde stammen^29,30. PCR gevolgd door DNA-sequencing is een gevoelige en specifieke methode om de Borrelia-soort te detecteren en genetisch te identificeren of te bevestigen^30,31,32,33.

Er bestaan veel kleine variaties op BSK-II en sommige zijn in de handel verkrijgbaar. Het hier in deel 1 beschreven protocol is overgenomen uit Barbour (1984)²¹. Vloeibaar MKP-medium is een recenter ontwikkeld medium en wordt beschreven in rubriek 2. Het wordt bereid volgens een eerder gerapporteerd protocol^33,34, dat, net als BSK-medium^, uit twee stappen bestaat: bereiding van basismedium en bereiding van volledig medium. Borrelia kweekmedium kan worden bereid met of zonder antibiotica, zoals beschreven in rubriek 3; de antibioticawet ter vermindering van verontreinigende bacteriën die worden geïntroduceerd bij het inenten met klinische of omgevingsmonsters, zoals beschreven in rubriek 4; bij inenten met pure Borrelia sp. cultuur zijn antibiotica mogelijk niet nodig. Het maken van Borrelia-aandelen op lange termijn is vaak belangrijk en een protocol hiervoor wordt beschreven in hoofdstuk 5. Rubriek 6 beschrijft het gebruik van deze media om zuivere Borrelia sensu lato-klonen te isoleren uit klinische of omgevingsmonsters. Er zijn een aantal benaderingen mogelijk³⁶; Hieronder is er een die effectief blijkt te zijn. Het beplatingsmedium dat in dit protocol wordt gebruikt, is een modificatie van BSK-II-platingmedium³⁷ en MKP-medium 34 (met konijnenserum verhoogd tot 10%³⁸).

Protocol

Alle studies met monsters verkregen van menselijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de relevante universiteit en / of medische faciliteit, en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van deelnemers voordat de monsters werden verzameld. Alle studies met monsters verkregen van dieren werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de institutionele commissie voor dierethiek. In voorkomend geval zijn goedkeuringen verkregen voor milieubemonstering. <p cla…

Representative Results

Borrelia-cultuurmedia BSK en MKP, en varianten, zijn rijke cultuurmedia met ingrediënten die sequentieel moeten worden bereid en gesteriliseerd. Indien correct bereid, moet BSK-medium roodoranje en helder zijn (figuur 1). Troebelheid en neerslag die na opwarming aanhouden, duiden op problematische ingrediënten, gemiddelde productie of verontreiniging; Een dergelijk medium kan het beste worden weggegooid. Als gelatine wordt toegevoegd aan BSK en met MKP, zal het medium gelatineus z…

Discussion

De laboratoriumkweek van bacteriën is de springplank voor onderzoek. Het diepgaande voordeel dat wordt verleend door het vermogen om te kweken, wordt geïllustreerd door de strijd, meer dan een eeuw die pas onlangs in succes culmineerde, om Treponema pallidum te kweken, de spirocheet die de etiologische agent van syfilis is⁴⁴. Borrelia spirocheten zijn ook een uitdaging voor cultuur, maar cultuur is mogelijk 23,24,34,44,45,46,47,48,49.<sup clas…

Materials

1.7 mL tubes	VWR	87003-294	Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter	VWR	28145-501	Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip	Neptune	BT10XLS3	Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes	Celltreat	229011B	Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip	Neptune	BT1000.96	Standard item – any supplier will do
15 mL tube	Celltreat	188261	Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip	Neptune	BT20	Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe	BD	309661	Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip	Neptune	BT200	Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes	Fisher Scientific	14-933C	Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes	Celltreat	229025B	Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe	BD	309657	Standard item – any supplier will do
35% BSA	Sigma	A-7409	Source is important – see note
5 mL Serological pipettes	Celltreat	229006B	Standard item – any supplier will do
50 mL tube	Celltreat	229421	Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes	Schott	Schott Nr. 26 135 115	Standard item – any supplier will do
Amikacine	Sigma	PHR1654	Standard item – any supplier will do
Amphotericin B	Sigma	A9528-100MG	Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole	Sigma	PHR1126-1G	Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth	BD	211088	Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet	Labconco	302419100	Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD)	Fisher Scientific	BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD)	Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]	Darlynn biologicals	BB83-500	Standard item – any supplier will do
centrifuge	Eppendorf	model 5430	Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate	Sigma	C-8532 100 g	Standard item – any supplier will do
CMRL	Gibco BRL	21540 500 mL	Standard item – any supplier will do
CMRL-1066	Gibco	21-510-018	Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene)	Fisher Scientific	5000-0020	Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm	Sigma	P7741	Standard item – any supplier will do
Digital Incubator	VWR	model 1545	Standard item – any supplier will do
DMSO	ThermoFisher	D12345	Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization	Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane	SCGPU05RE	Standard item – any supplier will do
Gelatin	Difco BD	214340 500 g	Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes	Fisher Scientific	99449-20	Standard item – any supplier will do
Glucose	Sigma	G-7021 1 kg	Standard item – any supplier will do
Glycerol	Sigma	G5516	Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge )	Labwissen	Model 3220	Standard item – any supplier will do
HEPES	Sigma	H-3784 100 g	Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine	Sigma	A-3286 25 g	Standard item – any supplier will do
Neopeptone	Difco  BD	211681 500 g	Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer	Sigma	Z359629	Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope	Leitz		Standard item – any supplier will do
Phosphomycin	Sigma	P5396-1G	Standard item – any supplier will do
Phosphomycine	Sigma	P5396	Standard item – any supplier will do
Pipetboy	Integra		Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance	OHAUS	model TS200S	Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt)	Sigma	P-8574 25 g	Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum	Gibco	16-120-032	Source is important
Rabbit Serum	Sigma	R-4505  100 mL	Source is important
Rifampicin	Sigma	R3501-1G	Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate	Sigma	S-5761     500 g	Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole	Sigma	PHR1126	Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate	Difco  BD	255752 100 g	Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes	VWR	470225-044	Standard item – any supplier will do
Trimethoprim	Sigma	PHR1056	Standard item – any supplier will do