Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex 및 재발 발열 Borrelia의 Spirochetes 재배 방법

Summary

시험관 내 배양은 살아있는 박테리아의 존재에 대한 직접적인 검출 방법입니다. 이 프로토콜은 Borrelia burgdorferi sensu lato complex, 재발 열 Borrelia 종 및 Borrelia miyamotoi를 포함하여 다양한 Borrelia spirochetes의 배양 방법을 설명합니다. 이 종은 까다 롭고 느리게 자라지 만 배양 할 수 있습니다.

Abstract

Borrelia는 B. burgdorferi sensu lato (sl)라고도 알려진 라임 보렐리 아증 (LB) 그룹의 세 그룹으로 구성되며 최근에는 Borreliella, 재발 열 (RF) 그룹 Borrelia 및 세 번째 파충류 관련 스피로 체타 그룹으로 재 분류되었습니다. 배양 기반 방법은 체액 또는 조직에서 병원체를 배양하여 복제 병원체를 직접 감지하고 연구를 위한 소스 자료를 제공하기 때문에 연구 및 임상 작업 모두에서 실험실 박테리아 감염 검출을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. Borrelia와 Borreliella spirochetes는 까다롭고 느리게 자라기 때문에 일반적으로 임상 목적으로 배양되지 않습니다. 그러나 연구에는 문화가 필요합니다. 이 프로토콜은 B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis 및 RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis 및 B. miyamotoi. LB 및 RF 스피로헤타를 성장시키기 위한 기본 배지는 Barbour-Stoenner-Kelly(BSK-II 또는 BSK-H) 배지로, 기존 배양에서 스피로헤타의 성장을 안정적으로 지원합니다. 접종물에서 초기 스피로헤타 수가 적은 진드기 또는 숙주 유래 샘플에서 새로 분리된 Borrelia 분리물을 성장시킬 수 있으려면 변형된 Kelly-Pettenkofer(MKP) 배지가 선호됩니다. 이 배지는 또한 B. miyamotoi 의 성장을 지원합니다.RF 스피로헤타 재배의 성공 여부는 성분의 품질에 크게 좌우됩니다.

Introduction

Borrelia는 라임 보렐리오스(LB) 그룹, 재발열(RF) 그룹 및 파충류에 국한된 것처럼 보이는 덜 잘 특성화된 그룹의 세 가지 주요 분기군을 포함하는 스피로헤타 박테리아의 속입니다. Borrelia 분류학은 대부분의 다른 분류학적 그룹 1,2,3,4,5,6,7과 마찬가지로 게놈과 프로테옴 비교를 허용하는 분자 방법론의 출현과 함께 유동적입니다. LB 그룹(라임병 그룹이라고도 함)은 전통적으로 가장 특징적인 구성원인 Borrelia burgdorferi sensu stricto의 이름을 따서 Borrelia burgdorferi sensu lato라고 불렸습니다.  이 논문은 현재 가장 널리 사용되는 용어인 LB, RF 및 파충류 관련 그룹을 사용하고 LB 및 RF 그룹에 대한 배양 프로토콜을 설명합니다.

Spirochaetaceae 계통의 구성원에게 예상되는 바와 같이 Borrelia는 일반적으로 길이 20-30 μm, 너비 0.2-0.3 μm의 독특하고 길고 얇은 나선형 모양을 채택 할 수 있습니다. 그러나 Borrelia 세포는 매우 다형성이며 복잡한 세포 및 유전 구조의 결과로 배양 및 생체 내 ^1,8 모두에서 다른 많은 모양을 채택할 수 있습니다. 스피로헤탈 형태에서 평면 사인파 형태는 내막과 외막 사이의 주변세포질 공간에서 회전하는 축 방향 내편모충의 결과입니다. 이 구조는 세포가 숙주 조직과 상호 작용할 수 있도록 하는 단백질을 포함하는 외막과 함께 세포가 매우 운동성을 가질 수 있도록 합니다 ^9,10. 외막 단백질의 발현은 엄격하게 조절되며 숙주 조직 침습뿐만 아니라 숙주 면역계와의 상호 작용에도 영향을 미친다¹¹. 이 복잡한 유전자 발현은 Borrelia 세포가 척추동물 숙주와 무척추동물 벡터의 매우 다른 환경 사이를 왕복할 수 있도록 합니다. Borrelia의 게놈은 원형 염색체가 아닌 선형 염색체로 구성된 원핵 생물 중에서 드뭅니다. 선형 염색체 외에도 Borrelia 종에는 7-21 개의 플라스미드가 포함되어 있으며 일부는 선형이고 일부는 원형입니다. 플라스미드는 숙주 적응 및 독성에 필요한 대부분의 유전자를 보유하고 있으며, 프로파지에서 유래한 원형 플라스미드는 스피로헤탈 세포 사이의 수평 유전자 흐름의 대부분을 담당하는 것으로 생각됩니다^12,13. 숙주 적응에서의 역할과 일관되게, 라임 보렐리아증(Lyme borreliosis) 그룹의 일부, 아마도 많은 구성원 또는 전부가 배양에서 플라스미드를 잃는다¹⁴. 가장 잘 연구된 B. burgdorferi, B31의 “실험실 적응” 균주는 이 종의 야생 분리주에서 발견되는 9개의 플라스미드 중 7개만 가지고 있다¹⁵. 유사하게, B. garinii는 배양물¹⁶에서 플라스미드를 잃는다. 일부 연구에서는 RF종과 B. miyamotoi가 배양 시 플라스미드를 보유하는 것으로 나타났으나 14,17^, 최근 연구에서는 장기간 체외 배양을 통해 플라스미드와 감염성이 변화된 것으로 나타났다¹⁸.

배양 기반 방법은 연구 및 임상 작업 모두에서 박테리아 감염의 실험실 검출을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다^14,17. 체액 또는 조직에서 병원체의 배양은 복제 병원체를 직접 감지하고 연구를위한 소스 자료를 제공합니다^14,17. 이 프로토콜은 LB 그룹과 RF Borrelia 및 B. miyamotoi의 스피로헤타를 성공적으로 배양하는 데 필요한 방법론과 레시피를 보여줍니다. Borrelia spirochetes를 재배하기 위한 기본 배지는 오염된 원핵생물의 성장을 줄이기 위해 항생제를 사용하거나 사용하지 않는 Barbour-Stoenner-Kelly 배지(BSK-II 또는 상업적으로 이용 가능한 BSK-H)입니다. 이 매체는 원래 RF Borrelia¹⁹를 지원하는 데 사용된 매체에서 채택되었으며 Stoenner²⁰과 Barbour²¹에 의해 추가로 수정되었습니다. 그 이후로 많은 변형이 개발되었으며, 각각은 성장, 감염성 및 병원성에 영향을 미칠 수 있는 박테리아 생리학에 영향을 미친다²². 이 배지는 확립된 배양균에서 스피로헤타의 성장을 안정적으로 지원하며, 진드기, 포유류, 임상 검체에서 스피로헤타를 분리하는 데 사용되어 왔다²³. 보다 최근에 개발된 변형인 변형된 Kelly-Pettenkofer(MKP) 배지는 배양에 사용할 수 있는 샘플에 존재하는 스피로헤타의 수가^23,24개 낮을 때 환경 샘플에서 새로운 Borrelia 분리주를 분리할 때 더 나은 분리 성공, 형태 및 운동성을 제공할 수 있습니다. 모든 경우에 재배의 성공 여부는 신선하게 준비된 배지와 적절한 재료의 사용에 크게 좌우됩니다. 모든 상업용 성분이 고품질 매체를 생산하는 것은 아닙니다. 접종된 배양물은 소량의 잔류 주변 산소의 존재 하에 통상적인 32-34°C 인큐베이터에서 진탕 없이 편리하게 인큐베이션될 수 있다. Borrelia spirochetes는 혐기성 세균이지만 본질적으로 산소 및 이산화탄소 농도의 변동에 노출되며 유전자 발현의 변화에 반응합니다^26,27,28,29. 따라서 유전자 발현, 성장 및 기타 대사 연구는 산소 제어 인큐베이터 또는 혐기성 챔버를 사용하여 산소 및 이산화탄소 수준을 제어해야 합니다. 배양에서 배양은 암시야 현미경 또는 위상차 현미경을 사용하여 스피로헤타의 존재 여부를 매주 또는 더 자주 확인합니다. 배양 도말은 은 염색, 면역조직화학, 또는 형광 태그가 부착된 균주^29,30을 사용하여 염색할 수 있습니다. PCR 후 DNA 시퀀싱은 Borrelia 종^30,31,32,33을 검출하고 유전적으로 식별하거나 확인하는 민감하고 특이적인 방법입니다.

BSK-II에는 많은 사소한 변형이 존재하며 일부는 상업적으로 이용 가능합니다. 섹션 1에서 여기에 설명된 프로토콜은 Barbour(1984)²¹에서 채택되었습니다. 액체 MKP 배지는 보다 최근에 개발된 배지이며 섹션 2에 설명되어 있습니다. 이전에보고 된 프로토콜^33,34에 따라 제조되며^, BSK 배지와 유사하게 기본 배지 준비 및 완전 배지 준비의 두 단계로 구성됩니다. Borrelia 배양 배지는 섹션 3에 설명된 바와 같이 항생제를 사용하거나 사용하지 않고 제조할 수 있습니다. 항생제는 섹션 4에 설명된 대로 임상 또는 환경 샘플을 접종할 때 유입되는 오염 박테리아를 줄이는 역할을 합니다. 순수한 Borrelia sp. 배양액으로 접종하는 경우 항생제가 필요하지 않을 수 있습니다. 장기 Borrelia 주식을 만드는 것은 종종 중요하며 이를 위한 프로토콜은 섹션 5에 설명되어 있습니다. 섹션 6은 이러한 배지를 사용하여 임상 또는 환경 샘플에서 순수한 Borrelia sensu lato 클론을 분리하는 방법을 설명합니다. 가능한 여러 가지 접근법이 있습니다³⁶; 아래는 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에 사용된 도금 매체는 BSK-II 도금 매체³⁷ 및 MKP 배지 34(토끼 혈청이 10%³⁸로 증가)의 변형입니다.

Protocol

인간 피험자로부터 얻은 샘플과 관련된 모든 연구는 관련 대학 및/또는 의료 시설의 기관 검토 위원회의 승인을 받았으며 샘플을 수집하기 전에 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 동물에서 채취한 샘플과 관련된 모든 연구는 기관 동물 윤리 위원회의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 해당되는 경우 환경 샘플링에 대한 승인을 받았습니다. 참고: 문화의 성공은 ?…

Representative Results

Borrelia 배양 배지 BSK 및 MKP 및 변종은 순차적으로 준비하고 멸균해야 하는 성분이 포함된 풍부한 배양 배지입니다. 올바르게 준비되면 BSK 배지는 빨간색-주황색이고 투명해야 합니다(그림 1). 온난화 후에도 지속되는 탁도와 강수량은 문제가있는 성분, 중간 생산 또는 오염을 나타냅니다. 이러한 매체는 폐기하는 것이 가장 좋습니다. 젤라틴이 BSK와 MKP에 첨가되면 냉장…

Discussion

박테리아의 실험실 배양은 연구의 발판입니다. 배양 능력에 의해 부여되는 심오한 이점은 매독의 병인인 스피로헤타인 Treponema pallidum을 배양하기 위한¹⁰⁰년 이상의 투쟁에서 예시됩니다 44. Borrelia spirochetes도 문화에 도전하지만 문화는 가능합니다 23,24,34,44,45,46,47,48,49.<s…

Materials

1.7 mL tubes	VWR	87003-294	Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter	VWR	28145-501	Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip	Neptune	BT10XLS3	Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes	Celltreat	229011B	Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip	Neptune	BT1000.96	Standard item – any supplier will do
15 mL tube	Celltreat	188261	Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip	Neptune	BT20	Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe	BD	309661	Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip	Neptune	BT200	Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes	Fisher Scientific	14-933C	Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes	Celltreat	229025B	Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe	BD	309657	Standard item – any supplier will do
35% BSA	Sigma	A-7409	Source is important – see note
5 mL Serological pipettes	Celltreat	229006B	Standard item – any supplier will do
50 mL tube	Celltreat	229421	Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes	Schott	Schott Nr. 26 135 115	Standard item – any supplier will do
Amikacine	Sigma	PHR1654	Standard item – any supplier will do
Amphotericin B	Sigma	A9528-100MG	Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole	Sigma	PHR1126-1G	Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth	BD	211088	Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet	Labconco	302419100	Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD)	Fisher Scientific	BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD)	Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]	Darlynn biologicals	BB83-500	Standard item – any supplier will do
centrifuge	Eppendorf	model 5430	Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate	Sigma	C-8532 100 g	Standard item – any supplier will do
CMRL	Gibco BRL	21540 500 mL	Standard item – any supplier will do
CMRL-1066	Gibco	21-510-018	Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene)	Fisher Scientific	5000-0020	Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm	Sigma	P7741	Standard item – any supplier will do
Digital Incubator	VWR	model 1545	Standard item – any supplier will do
DMSO	ThermoFisher	D12345	Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization	Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane	SCGPU05RE	Standard item – any supplier will do
Gelatin	Difco BD	214340 500 g	Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes	Fisher Scientific	99449-20	Standard item – any supplier will do
Glucose	Sigma	G-7021 1 kg	Standard item – any supplier will do
Glycerol	Sigma	G5516	Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge )	Labwissen	Model 3220	Standard item – any supplier will do
HEPES	Sigma	H-3784 100 g	Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine	Sigma	A-3286 25 g	Standard item – any supplier will do
Neopeptone	Difco  BD	211681 500 g	Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer	Sigma	Z359629	Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope	Leitz		Standard item – any supplier will do
Phosphomycin	Sigma	P5396-1G	Standard item – any supplier will do
Phosphomycine	Sigma	P5396	Standard item – any supplier will do
Pipetboy	Integra		Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance	OHAUS	model TS200S	Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt)	Sigma	P-8574 25 g	Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum	Gibco	16-120-032	Source is important
Rabbit Serum	Sigma	R-4505  100 mL	Source is important
Rifampicin	Sigma	R3501-1G	Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate	Sigma	S-5761     500 g	Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole	Sigma	PHR1126	Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate	Difco  BD	255752 100 g	Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes	VWR	470225-044	Standard item – any supplier will do
Trimethoprim	Sigma	PHR1056	Standard item – any supplier will do