Summary
Å oppnå sterilisering er viktig for trakealvevstransplantasjon. Her presenterer vi en steriliseringsprotokoll ved bruk av lavdose gammabestråling som tolereres fullt ut av organer.
Abstract
En av de viktigste viktigste aspektene for å sikre at en transplantasjon utvikler seg riktig, er mediets sterilitet. Decellularisert trakealtransplantasjon innebærer å implantere et organ som opprinnelig var i kontakt med miljøet, og dermed ikke være sterilt fra begynnelsen. Mens decellulariseringsprotokollen (gjennom vaskemiddelutstilling [2% natriumdodecylsulfat], kontinuerlig omrøring og osmotiske sjokk) utføres i tråd med aseptiske tiltak, gir den ikke sterilisering. Derfor er en av hovedutfordringene å sikre sterilitet før in vivo implantasjon. Selv om det er etablert gammastrålingssteriliseringsprotokoller for uorganiske materialer, er det ingen slike tiltak for organiske materialer. I tillegg kan protokollene som er på plass for uorganiske materialer ikke brukes på organisk materiale, da den etablerte stråledosen (25 kGy) ville ødelegge implantatet fullstendig. Denne artikkelen studerer effekten av en eskalert stråledose i et decellularisert kaninluftrør. Vi opprettholdt doseområdet (kGy) og testet eskalerte doser til vi fant den minste dosen der sterilisering oppnås. Etter å ha bestemt dosen, studerte vi effekter av den på orgelet, både histologisk og biomekanisk. Vi fastslo at mens 0,5 kGy ikke oppnådde sterilitet, gjorde doser på både 1 kGy og 2 kGy det, med 1 kGy derfor den minimale dosen som var nødvendig for å oppnå sterilisering. Mikroskopiske studier viste ingen relevante endringer sammenlignet med ikke-steriliserte organer. Aksiale biomekaniske egenskaper ble ikke endret i det hele tatt, og bare en liten reduksjon i kraften per lengdeenhet som orgelet radialt kan tolerere ble observert. Vi kan derfor konkludere med at 1 kGy oppnår fullstendig sterilisering av decellularisert kaninluftrør med minimal, om noen, effekt på organet.
Introduction
Sterilisering av et implantat er en grunnleggende forutsetning for levedyktigheten; Faktisk er proteser som har vist seg å være vellykkede, de som er implantert i sterile områder (blodårer, hjerte, bein, etc.) 1. Luftrøret har to overflater: en overflate i kontakt med det ytre miljø, som derfor ikke er steril, og en overflate mot mediastinum, som er steril. Derfor, fra det øyeblikket luftrøret ekstraheres, er det ikke et sterilt organ. Til tross for at den etterfølgende decellulariseringsprosessen utføres under maksimale sterile forhold, er det ikke et steriliseringstrinn2. Implantasjon av fremmedlegemer medfører i seg selv en risiko for infeksjon på grunn av det probakterielle mikromiljøet det produserer3og opptil 0,014% risiko for sykdomsoverføring fra donor til mottaker, selv om materialet er sterilisert4. For å sikre korrekt vaskularisering av luftrøret, i nesten alle eksperimentelle transplantasjonsprotokoller, gjennomgår det først heterotopisk implantat 5,6,7 til et sterilt område (muskel, fascia, omentum, subkutan, etc.); Dette skyldes at implantering av et ikke-sterilt element i dette mediet vil føre til infeksjon av området3.
Det finnes en rekke mulige strategier for å oppnå et sterilt implantat. Bruk av superkritisk CO2har oppnådd terminal sterilisering 8,9. Andre metoder, som ultrafiolett stråling eller behandling med stoffer som pereddiksyre, etanol, oksygenperoksid og elektrolysert vann, har oppnådd forskjellige suksessrater i sterilisering, nesten alltid avhengig av doseringene, men de har vist seg å påvirke de biomekaniske egenskapene til implantater. Faktisk kan noen stoffer, som etylenoksid, vesentlig endre strukturen til den implanterte matriksen og kan til og med forårsake uønskede immunogene effekter. Av denne grunn kan mange av disse strategiene ikke brukes på biologiske modeller 2,10,11,12,13.
Den mest studerte og aksepterte steriliseringsstrategien er den som er etablert av ISO 11737-1: 2006-standarden for sterilisering av medisinsk utstyr implantert hos mennesker, med en gammastrålingsdose på 25 kGy. Denne forskriften fokuserer imidlertid bare på sterilisering av inerte, ikke-biologiske elementer14,15. I tillegg er strålebehandlingsdoser i radikal behandling av karsinom tre størrelsesordener lavere enn de som brukes til å sterilisere medisinsk utstyr1. Med dette i bakhodet kan vi konkludere med at nevnte dose ikke bare ville drepe mikrobiotaen, men også ødelegge og radikalt endre implantatets biologiske struktur. Det er også mulighet for at det vil generere gjenværende lipider ved nedbrytning, som potensielt kan være cytotoksisk og akselerere den enzymatiske nedbrytningen av stillaset 13,14,15,16,17, selv ved bruk av doser så lave som 1,9 kGy og med skade direkte proporsjonal med mottatt stråledose 17.
Dermed er målet med denne artikkelen å prøve å identifisere stråledosen som gjør det mulig å oppnå et sterilt implantat med minimale skadelige effekter forårsaket av bestråling 2,18,19. Strategien vi fulgte innebar bestråling av decellulariserte og bestrålte luftrør ved forskjellige eskalerte doser innenfor et område av kilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, etc.), til man oppnådde en negativ kultur. Ytterligere tester ble utført for de dosene som oppnådde negative kulturer for å bekrefte sterilisering. Etter å ha bestemt minimumsdosen for å oppnå sterilisering ble den strukturelle og biomekaniske virkningen av bestrålingen på luftrøret kontrollert. Alle beregningene ble sammenlignet med kontrollens innfødte kaninluftrør. Steriliseringen av konstruksjonen ble deretter testet in vivo ved å implantere luftrørene i New Zealand hvite kaniner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det europeiske direktivet 20170/63/EU for stell og bruk av forsøksdyr ble fulgt, og studieprotokollen ble godkjent av etikkomiteen ved Universitetet i Valencia (lov 86/609/EØF og 214/1997 og kode 2018/VSC/PEA/0122 Type 2 fra regjeringen i Valencia, Spania).
1. Trakeal decellularisering
MERK: Decellulariseringsmetoden er rapportert andre steder20.
- Avliving av donorhann voksen New Zealand hvite kaniner (Oryctolagus cuniculus) som veier 3,5-4,1 kg med 133 mg/kg pentobarbitalnatrium, ved bruk av en 200 mg/ml injeksjon gjennom den marginale ørevenen.
- Mens du sikrer aseptiske forhold, utfør en sentral langsgående cervikotomi, dissekere livmorhalsmusklene og nærme deg luftrøret. Dissekere orgelet omkretsende og langsgående. Til slutt, transekt under den første ringen og like over carina.
- Med en skalpell, seksjon luftrørene i 2 cm stykker. Fjern det omkringliggende bindevevet og det indre slimhinnelaget6 med saks.
- Senk prøvene i 12 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS) som inneholder 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 5% penicillin-streptomycin og 5% amfotericin B.
- Utsett luftrørene for konstant omrøring med en magnetisk omrører ved 400 o / min i 5 uker ved romtemperatur. Bytt ut decellulariseringsløsningen ukentlig etter et 2 timers osmotisk sjokk, ved nedsenking av luftrøret i destillert vann.
- Kryogeniser prøvene ved hjelp av en 12 ml blanding av 80% føtalt bovint serum (FBS) og 20% dimetylsulfoksid (DMSO) i en frysebeholder ved -80 ° C.
- Når luftrørene skal brukes (etter 13-15 dager), tine dem i et vannbad ved 37 °C og vaske dem ved å senke dem i PBS etter at tiningen er fullført.
2. Sterilisering
- Bestråling
- Plasser partier med fire trakealstykker som måler 2 cm hver i en 20 ml metakrylat i T25 kulturkolbe fylt med PBS til et totalt volum på 30 ml er nådd. Pass på å forhindre at bobler dannes, noe som kan forårsake energidiffusjon i luft-væskegrensesnittet.
- Utfør bestråling ved hjelp av en lineær akselerator, med fotoner med en nominell energi på 10 MV flattningsfilter frie stråler. Påfør en doserate på 2 400 monitorenheter per minutt i isosenteret, plasser luftrørene i en kildeoverflateavstand på 100 cm som skal bestråles, med en dybdeskarphet på 2,5 cm for et strålingsfelt på 10 cm x 10 cm - slik at hele beholderen dekkes - tilsvarende en dose på 24 Gy / min.
- Eskalere dosene med hver firedelt batch; fire stykker vil bli utsatt for 0,5 kGy, fire til 1 kGy, fire til 2 kG, etc., til sterilisering er nådd.
- Kultur
- Introduser bitene i 30 ml Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) med inaktivert 10% FBS uten antibiotika eller antifungale midler.
- Dyrk dem i en standard vevsinkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 i2 uker og inspiser dem hver 24. time.
MERK: Forurensningsparametrene er endringer i pH i kulturmediet og følgelig endringer i fargen og turbiditeten til mediet. Luftrørene ble høstet fra bakteriefrie lagomorfer, som ikke var syke og dermed forventet å være blottet for anaerobe bakterier i luftrøret.
3. Histologisk analyse
MERK: Beis bitene med hematoksylin og eosin21, Massons trichrome og orcein22.
- DAPI farging
- Bestem vevets levedyktighet ved hjelp av DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol). Denne blåblomstrende flekken binder seg sterkt til adenin- og tyminrike områder i DNA-sekvenser, og gjør det derfor mulig å se DNA via fluorescensmikroskopi.
- Legg inn vevsprøvene i optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse.
- Klipp prøvene ved hjelp av en kryostat.
- Vask prøven som skal farges tre ganger i destillert vann for å fjerne OCT. Plasser i monteringsmedium som inkluderer en 30 nM-løsning av DAPI.
- Visualiser fluorescens ved hjelp av fluorescensmikroskopi.
- Analyse av DNA-innhold
- Kutt segmenter av luftrøret som måler ca 3 mm lang ved hjelp av en skalpell.
- Inkuber i 2 timer i proteinase K (materialfortegnelse).
- Ekstraher DNA med et DNA-ekstraksjonssett, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Ved hjelp av spektrofotometri, bestemme konsentrasjonen av DNA ved å måle absorbansen ved 260/280 ved hjelp av et spektrofotometer.
- Mål størrelsen på de ekstraherte DNA-prøvene ved hjelp av kapillærkromatografi med en bioanalysator.
4. Biomekanisk studie
MERK: Trakeal motstand mot langsgående og tverrgående krefter måles gjennom aksiale strekk- og radiale kompresjonstester23.
- Trakeal måling
- Mål trakeallengden, veggtykkelsen og den ytre diameteren ved hjelp av en Vernier-tykkelse.
- Beregn gjennomsnittsverdiene fra tre tilfeldige målinger av hver av variablene.
- I de radiale kompresjonstestene beregner du den anteroposterior diameteren ved å oppdage punktet der platen kommer i kontakt med prøven.
- Utfør alle tester ved romtemperatur.
- Strekkprøver
- Utfør strekktester på en trekkraftstasjonær universell testmaskin (UTM) forskyvningskontroll, utstyrt med en 100 N belastning (0,1 N kraftoppløsning, 0,001 mm posisjon og 0,1 s). Testmaskinen er utstyrt med kraft- og posisjonssensorer, og er koblet til en datamaskin med programvare spesielt utviklet av produsenten23.
- Registrer data hver 0,4 s og eksporter til et regneark.
- Konstruer strekkkjever tilpasset gjennomsnittlig kaliber av kaninluftrørene fra rene monolags, giftfrie krystallpolyvinylklorid (PVC) hule rør med en ytre diameter på 1 cm og en veggtykkelse på 1,5 mm.
- Seksjon lederne i 3 cm lange segmenter.
- Bor 12 preformerte hull for termino-terminal sutur, 2 mm fra kjevekanten og atskilt med en avstand på 2,5 mm, for å forhindre skjevhet på grunn av suturene.
- Fest PVC-glassrørene til kaninluftrøret ved termino-terminal anastomose med kontinuerlig sutur gjennom alternative preformerte hull (hver 5 mm), 2 mm fra kanten av luftrøret og med en 6-0 nylon monofilament sutur.
- Strekk alle bitene med en forskyvningshastighet på 5,0 mm/min.
- Registrer variablene maksimal belastning (σ max, i N / mm2) og belastning (εmax, uten enheter), sammen med energien lagret per enhet av luftrørsvolum (W / Vol, i mJ / mm), og Youngs modul (E, i MPa).
- Radiale kompresjonstester
- Utfør radiale kompresjonstester på et kompresjonsskrivebord UTM, utstyrt med en 15 N lastcelle (kraftoppløsning 0,001 N, posisjon 0,001 mm og tid 0,1 s) for å oppnå kraftdata (N), posisjon (mm) og tid (er). Registrer data og eksporter til regneark med intervaller på 0,5 s.
- Plasser luftrørene med membranområdet som hviler på den nedre platen. Platen stiger gradvis opp mot topplaten med en konstant hastighet på 5 mm/min.
- Beregn hver enhet per lengdeenhet av prøven (f i N / mm), stivhet (R i Mpa·mm) og energien per overflateenhet (B / S i mJ / mm2) som trengs for å okkludere luftrøret helt.
5. Kirurgisk teknikk
MERK: Den kirurgiske teknikken har blitt mye rapportert andre steder20.
- Plasser en steril intraluminal PVC-stent, størrelse 14 Fr (som gjør at den kan gli fritt uten å komprimere veggene), med en 3-4 mm margin i hver ende.
- Fest stenten med en enkelt 6-0 nylonmonofilamentsøm gjennom det interkartilaginøse rommet til den første brusk.
- Fortsett å bedøve kaninene.
- Premedisinere forsøkspersonene (3,65-4,05 kg hvite kaniner fra New Zealand) med intramuskulære analgetika (35 mg/kg ketamin) med et beroligende, muskelavslappende middel og smertestillende middel (2,5 mg/kg xylazin).
- Barber snittsonen ut av operasjonssonen og rengjør operasjonsområdet for å fjerne håret.
- Gi analgetika pluss antibiotikaprofylakse: 0,05 mg/kg intramuskulær buprenorfin og 10 mg/kg enrofloksacin.
- Sett et venøst kateter i den marginale ørevenen til hver kanin.
- Induksjonsanestesi med en intravenøs bolus på 10 mg/kg propofol.
- Overvåk dyrets vitale tegn ved hjelp av et tre-bly elektrokardiogram, pulsoksimetri og ikke-invasiv trykkmåling. Hvert 30. minutt, bruk fysiologisk serum til øynene for å forhindre tørrhet under anestesi.
- Bekreft bedøvelsesplanet ved hjelp av tåklemmemetoden.
- Oppretthold anestesi med inhalert isofluran ved 1,5% -2% av den minste alveolære konsentrasjonen uten å miste spontan ventilasjon og gi termisk støtte til kaninen med en varmepute.
- Desinfiser snittsonen flere ganger i en sirkulær bevegelse med en jodbasert skrubbe. Under aseptiske forhold til enhver tid og med sterilt materiale, gjør et langsgående 3 cm sentralt thoraxsnitt, og høst bilaterale stilkede sammensatt av pectoral fascie og en muskelkomponent.
- Pakk luftrørene med klaffen i fire kaniner, en på hver hemithorax (dermed totalt åtte luftrør).
- Når operasjonen er fullført, reverseres anestesien ved å avbryte administrering av isofluran .
- Postoperativ periode
- Hold dyrene i operasjonssalen til de har fullstendig gjenopprettet fra anestesi. Når de har fullstendig gjenopprettet, returner dem til deres miljø med andre kaniner.
- Behandle kaniner med antibiotika (0,5 ml / kg av 2,5% enrofloksacin) og smertestillende midler (5 mg / ml meloksikam, 0,05 ml / kg metacam) hver 24 timer i 5 dager.
- La implantatene være på stedet i ønsket tid.
- Før eutanasi skal kaninene premedisineres med intramuskulære analgetika (35 mg/kg ketamin) og et beroligende, muskelavslappende og smertestillende middel (2,5 mg/kg xylazin). Avliv deretter kaninene med 133 mg/kg pentobarbitalnatrium med en 200 mg/ml injeksjon gjennom den marginale ørevenen og høst luftrørene.
- Utfør biomekaniske og histologiske tester på luftrørene.
6. Statistisk analyse
- Juster alle modellene etter den bayesianske metoden på R-programvare, versjon 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).
- Analyser studievariablene, unntatt f og R, ved hjelp av flere lineære regresjonsmodeller.
- For f- og R-variablene bruker du blandede lineære regresjonsmodeller. I disse modellene, i tillegg til variablene av interesse knyttet til behandling og tilstand av hver luftrør, introdusere prosentandelen okklusjon som en monotonisk effekt og et uavhengig begrep per luftrør som en tilfeldig faktor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularisering
DAPI-farging viser fravær av DNA, og ingen DNA-verdier høyere enn 50 ng ble påvist i noen av luftrørene ved elektroforese, med alle fragmenter mindre enn 200 bp20.
Mikrobiell kultur
To av de åtte delene som ble utsatt for 0,5 kGy viste fargeendring på mindre enn 1 uke. Ingen av bitene bestrålt ved 1 kGy og 2 kGy viste fargeendring (figur 1).
Histologisk analyse
Det ble ikke påvist endringer i kollagen- eller elastisk fiberfordelingsmønster i noen av de analyserte prøvene (figur 2).
Bestemme stråledosen
Gitt resultatene beskrevet over, som viste at bestråling ved 0,5 kGy ikke sikret sterilisering av preparatet, mens doser på 1 kGy og 2 kGy gjorde det, etablerte vi minste bestrålingsdose for å oppnå sterilisering av vevet som 1 kGy. Derfor testet vi den biomekaniske effekten av denne dosen på luftrørene 2,17,23.
Biomekanisk studie
Aksiale strekktester
Dataene fra strekktesten på bestrålte luftrør er vist i tabell 1. Figur 3 viser tilsvarende spenning-tøyningskurver og bristepunkter.
Å utsette trakealstykker for gammabestråling for steriliseringsformål, til tross for litt økning av de oppdagede verdiene, forårsaker således ikke signifikante effekter på organens aksiale biomekaniske egenskaper. Derfor σbåde maks som luftrørene tåler (0,05 MPa; CI [-0,046, 0,144] MPa), samt εmaks (0,096 CI [-0,096, 0,281]), (0,022 MPa; CI [-0, 23, 0, 274] MPa), og W / Vol (fra 0, 044 mJ / mm3; KI [-0,018, 0,106] mJ/mm3), er svært svakt økt i dette utvalget, men er uansett ikke anvendelige for populasjonsestimatet.
Radiale kompresjonstester
Kompresjonstestene utført på både de opprinnelige luftrørene (kontrollene) og på de decellulariserte, kryopreserverte og bestrålte luftrørene er vist i tabell 2. De tilsvarende grafene kan sees i figur 4.
Gammabestråling forårsaker bare en minimal, men signifikant reduksjon i radiale biomekaniske egenskaper i den variable kraften per lengdeenhet, som varierer med -0,017 N / mm; CI [-0,042, -0,004] N/mm, mens de minimale variasjonene ble oppdaget i W/Vol (0,044 mJ/mm3; CI [-0,018, 0,106] mJ/mm3), R (-0,018 MPa · mm; CI [-0,145, 0,083] MPa · mm) og W/S (-0,081 mJ/mm2; KI [-0,95, 0,74] mJ/mm2), er under ingen omstendigheter anvendelige for befolkningsestimatet (figur 5).
Implantat
Makroskopisk undersøkelse
Ingen av dyrene viste inflammatoriske eller smittsomme symptomer i den postoperative perioden; Kostholdet ble gjeninnført som planlagt, og antibiotika og smertestillende midler ble suspendert på dag fem. Ved eutanasi ble integrasjon av luftrør og observert makroskopisk, uten synlige tegn til inflammasjon.
Histologisk undersøkelse
Den histologiske undersøkelsen viste at dannet høyt organisert bindevev - nært knyttet til trakealringene, og viste kontinuitet mellom dem og vevet - i form av perichondrium av den opprinnelige luftrøret. Brusken var intakt og viste ingen tegn til nekrose. I tillegg ble tilstedeværelsen av makrofager og noen isolerte gigantiske celler som danner ark observert. Bortsett fra liten tilstedeværelse av eosinofile granulocytter ble det observert vanlig postkirurgisk mild akutt inflammatorisk cellularitet (figur 6). Begynnende neovaskularisering ble også observert rundt luftrøret.
Biomekanisk evaluering
Etter å ha blitt implantert i lagomorfen, forble egenskapene til luftrøret uendret, bortsett fra kraften per lengdeenhet, som gjenvunnet egenskapene til den opprinnelige luftrøret bare 2 uker etter transplantasjonen (0,006 N / mm, CI [-0,026, 0,04] N / mm) (figur 7).
Figur 1 Bestrålte luftrør ved DMEM uten antibiotika eller soppdrepende midler. Fargen på de to prøvene til venstre (0,5 kGy) har endret seg, noe som indikerer en endring i pH, og er et indirekte tegn på bakterievekst. Det er også økt turbiditet i det første prøven til venstre. De to eksemplarene til høyre (1 kGy) viser ingen fargeendring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Luftrør decellularisert og bestrålt i ulike doser. Hver rad tilsvarer en annen farging og hver kolonne til forskjellig steriliseringsdosering. 1) Hematoksylin-eosin. Panoramautsikt over brusk, slimhinner, submukosa og serosa. 2) Massons trichrome flekk. Trakeal submukosa. 3) Hematoksylin-eosin. Detaljert visning av trakealbrusk. (A) Ikke-bestrålte luftrør (kontroll). (B) Luftrør bestrålt ved 0,5 kGy. (C) Luftrør bestrålt ved 1 kGy. (D) Luftrør bestrålt ved 2 kGy. Fraværet av objektive histologiske endringer med hensyn til stråledosen observeres. Forkortelse: N = innfødt luftrør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Spenningsbelastningskurver for decellulariserte og bestrålte luftrør. Bristepunktet er markert med oransje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kurver for okklusjonsprosent tilsvarende trekktester i decellulariserte og bestrålte luftrør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Biomekanisk respons på bestråling. (A) Graf over marginale effekter på den variable kraften per lengdeenhet, i henhold til prosentandelen okklusjon av bestrålingsinteraksjonen. (B) Graf over marginale effekter på den variable kraften per lengdeenhet, i henhold til prosentandelen okklusjon av bestrålingsinteraksjonen. (C) Partiell avhengighetsplott av den lagrede energien per arealenhet modell for bestrålingsvariabelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Visning av implantert luftrør ved 2 uker . (A) Massons trikrome farging. Neoformet bindevev av den trakeale ytre overflaten organisert i konsentriske lag av fibre og celler observeres. (B) Hematoksylin-eosin. Panoramautsikt over perfekt bevart brusk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Graf over marginaleffekter av interaksjonen mellom kraft per lengdeenhet og prosentandel av okklusjon og kontroll (native) luftrør versus luftrørsimplantater ved 2 uker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1 Strekkprøver på bestrålte luftrør. Kontroller er innfødte kaninluftrør. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Kompresjonstester på bestrålt, decellularisert luftrør. Kontroller er innfødte kaninluftrør. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finnes flere steriliseringsstrategier som finnes. Superkritisk CO2trenger helt inn i vev, forsurer mediet og dekonstruerer det cellulære fosfolipid-dobbeltlaget med enkel eliminering ved hjelp av trykkavlastning av implantatet 8,14,25. Ultrafiolett stråling har også blitt brukt, og dens effektivitet i gnagerluftrøret er publisert, selv om det bare er noen få rapporter i litteraturen10. Andre metoder som brukes inkluderer bruk av stoffer som pereddiksyre, etanol, oksygenperoksid eller elektrolysert vann, som har gitt uregelmessige resultater og vist seg å påvirke vev11,12 sterkt. I motsetning til de nevnte strategiene har gammabestråling ikke bare vist seg å være helt effektiv når det gjelder sterilisering, men har også blitt grundig og kraftig studert, både med hensyn til dose og steriliserende effekter. Faktisk har det blitt studert så mye at det er en ISO-standard for bruk av gammastråling i sterilisering, hvor dosen for sterilisering av inert materiale som skal implanteres hos mennesker, er etablert ved 25 kGy13,14,15.
På den annen side, i tillegg til sterilisering av materiale, har bestråling også vist seg å forårsake sikkerhetseffekter som en begrensning av teknikken. Disse inkluderer ødeleggelse og endring av matriser ved denaturering av proteinmolekyler, inkludert kollagen, og genererer gjenværende molekyler, som til og med kan bli giftige. Denne nedbrytningen av organstruktur påvirker følgelig både dens biologiske og biomekaniske egenskaper, med de skadelige effektene av bestråling som er direkte proporsjonal med dosen og observeres ved relativt lave doser 13,14,15,16,17. Her var målet derfor todelt: på den ene siden å oppnå en steril konstruksjon for å sikre et levedyktig implantat, og på den andre siden å bevare de biologiske og biomekaniske egenskapene til matrisen, da implantatet ville være nytteløst med mindre begge ble opprettholdt26. Dermed var utfordringen å velge en strategi som tillot en balanse mellom vellykket sterilisering og bevaring av vevsstruktur.
Her ble 1 kGy fastsatt som minimumsdose for sterilisering. Histologisk undersøkelse viste at denne bestrålingsdosen ikke har noen innvirkning på vevet. Videre bestemte biomekanisk karakterisering av de bestrålte luftrørene at bruken av bestråling absolutt ikke gjør noen forskjell for trekkparametere. Det var en liten, men statistisk signifikant reduksjon i kraften per lengdeenhet som luftrøret var i stand til å tolerere i de radiale kompresjonstestene, men dette påvirker ikke de andre radiale egenskapene.
Mens det er noen få artikler som diskuterer umuligheten av sterilisering og destruksjon forårsaket av doser så lave som 1,5 kGy 19, er de aller fleste i tråd med de presenterte dataene 2,18,19. På denne måten observerer forfatterne at sterilisering av bein ved doser på 10, 15, 20 og 25 kGy oppnår fullstendig sterilisering, men i bytte for en reduksjon i celleinkubasjonskapasitet og en økning i kollagennedbrytningsprodukter ved doser høyere enn 15 kGy18. En dose på 1,5 kGy oppnådde ikke sterilisering i decellulariserte hjerteklaffer, men forårsaket skade på de mekaniske egenskapene til prøvene både in vivo og in vitro; I mellomtiden oppnådde en dose på 3 kGy sterilisering, men forårsaket destruksjon og fibrose19. Når det gjelder luftrøret, sammenlignet Johnson et al. effekten av sterilisering ved ISO-dosen på 25 kGy med en dose på 5 kGy. Begge dosene oppnådde terminal sterilisering, med dosen på 5 kGy som endret prøvens struktur noe og dosen på 25 kGy fullstendig destruerte luftrøret2.
I tillegg er effektiv sterilisering bekreftet takket være fravær av smittsomme hendelser med hensyn til implantatet etter 2 uker, med sterilisering som tolereres fullt ut av organene. Dessuten var strukturen fullstendig bevart, uten nekrose eller denaturering av orgelet. Videre ble det observert som et tilleggsfunn at den mindre endringen i biomekaniske egenskaper - til kraften som luftrøret er i stand til å tolerere per lengdeenhet - returnerte til verdiene av en innfødt luftrør bare 2 uker etter implantasjon; Derfor kan denne effekten ses bort fra i henhold til den endelige styringen av konstruksjonen.
Derfor presenterer dette papiret muligheten for å oppnå helt sterile organer ved mye lavere doser enn anbefalt dose på 25 kGy; forslaget feilsøker sterilisering av New Zealand kaninluftrør med en dose på 1 kGy. Denne dosen sikrer at de histologiske, ultrastrukturelle og biomekaniske egenskapene til disse organene opprettholdes, og viser perfekt toleranse for implantasjonen. En begrensning av studien er at den kun utføres på steriliserte kaninluftrør, som generelt krever lavere dosering på grunn av å være mindre i størrelse; Det kan imidlertid konkluderes med at de for høye tallene som er fastsatt i ISO-standarden for inerte implantater, ikke er nødvendige for sterilisering av decellulariserte luftrør, og dermed er en stor prestasjon på grunn av den sterkt reduserte skaden på vevet. Videre, i fremtidige studier, avhengig av dyret, og derfor på størrelsen på luftrøret, kan disse dosene justeres til mye lavere doser som følgelig er mer respektfulle for organets struktur og funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette papiret ble støttet av 2018 Spanish Society of Thoracic Surgery Grant til National Multicentric Study [Nummer 180101 tildelt Néstor J.Martínez-Hernández] og PI16-01315 [tildelt Manuel Mata-Roig] av Instituto de Salud Carlos III. CIBERER er finansiert av VI National R &D &I Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions og Instituto de Salud Carlos III, med bistand fra European Regional Development Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
- Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B.
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , Published online 2006 (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , McGraw-Hill. 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
