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Bioengineering

उत्तेजित रमन स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी के साथ टाइम-लैप्स लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक लचीला कक्ष

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/64449
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Binghamton University, State University of New York

Summary

हम संचारित सिग्नल डिटेक्शन के साथ सीधे उत्तेजित रमन स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं के टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए एक स्टेज-टॉप, लचीले पर्यावरण कक्ष की रिपोर्ट करते हैं। लिपिड बूंदों को 3 मिनट के समय अंतराल के साथ 24 घंटे तक ओलिक एसिड के साथ इलाज किए गए स्कोव 3 कोशिकाओं में चित्रित किया गया था।

Abstract

उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी एक लेबल-मुक्त रासायनिक इमेजिंग तकनीक है। एसआरएस के साथ लाइव-सेल इमेजिंग कई जैविक और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए प्रदर्शित किया गया है। हालांकि, जीवित कोशिकाओं की दीर्घकालिक समय-चूक एसआरएस इमेजिंग को व्यापक रूप से अपनाया नहीं गया है। एसआरएस माइक्रोस्कोपी अक्सर उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्राप्त करने के लिए एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) जल-विसर्जन उद्देश्य और एक उच्च एनए तेल-विसर्जन कंडेनसर का उपयोग करता है। इस मामले में, उद्देश्य और कंडेनसर के बीच का अंतर केवल कुछ मिलीमीटर है। इसलिए, अधिकांश वाणिज्यिक चरण-शीर्ष पर्यावरण कक्षों का उपयोग एसआरएस इमेजिंग के लिए नहीं किया जा सकता है क्योंकि उनकी बड़ी मोटाई एक कठोर ग्लास कवर के साथ है। यह पेपर एक लचीले कक्ष के डिजाइन और निर्माण का वर्णन करता है जिसका उपयोग एक ईमानदार माइक्रोस्कोप फ्रेम पर प्रेषित एसआरएस सिग्नल डिटेक्शन के साथ टाइम-लैप्स लाइव-सेल इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। कक्ष का लचीलापन एक नरम सामग्री का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है - एक पतली प्राकृतिक रबर फिल्म। नए बाड़े और कक्ष डिजाइन को आसानी से मौजूदा एसआरएस इमेजिंग सेटअप में जोड़ा जा सकता है। परीक्षण और प्रारंभिक परिणामों से पता चलता है कि लचीली कक्ष प्रणाली जीवित कोशिकाओं के स्थिर, दीर्घकालिक, समय-चूक एसआरएस इमेजिंग को सक्षम बनाती है, जिसका उपयोग भविष्य में विभिन्न बायोइमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

Introduction

ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग नमूनों के माइक्रोस्ट्रक्चर का निरीक्षण करने के लिए किया जाता है। ऑप्टिकल इमेजिंगअन्य प्रौद्योगिकियों की तुलना में तेजी से, कम आक्रामक और कम विनाशकारी है। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ लाइव-सेल इमेजिंग कोलंबी अवधि में सुसंस्कृत जीवित कोशिकाओं की गतिशीलता को पकड़ने के लिए विकसित किया गया है। विभिन्न प्रकार के ऑप्टिकल विरोधाभास जैविक नमूनों के बारे में अलग-अलग जानकारी प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, ऑप्टिकल चरण माइक्रोस्कोपी नमूना3 में अपवर्तक सूचकांक ों में सूक्ष्म अंतर को दर्शाता है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से विशिष्ट बायोमोलेक्यूल्स या सेलुलर ऑर्गेनेल की छवि बनाने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, फ्लोरेसेंस के ब्रॉडबैंड उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के परिणामस्वरूप आमतौर पर वर्णक्रमीय ओवरलैपिंग होती है जब मल्टीकलरइमेजिंग की जाती है। फ्लोरोसेंट अणु प्रकाश-संवेदनशील होते हैं और लंबे समय तक, आवधिक प्रकाश जोखिम के बाद ब्लीच किए जा सकते हैं। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति लेबलिंग कोशिकाओं में अणुओं के जैव वितरण को बदल सकतीहै। एसआरएस माइक्रोस्कोपी एक लेबल-मुक्त रासायनिक इमेजिंग तकनीकहै। एसआरएस का विपरीत विशिष्ट रासायनिक बंधों के कंपन संक्रमण पर निर्भर करता है। एक रासायनिक बंधन की कंपन आवृत्ति अक्सर एक संकीर्ण वर्णक्रमीय बैंडविड्थ प्रदर्शित करती है, जिससे एकही नमूने में कई रमन बैंड की छवि बनाना संभव हो जाता है। एसआरएस माइक्रोस्कोपी लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक अनूठा उपकरण है, जो लेबल-मुक्ततरीके से कई रासायनिक विरोधाभास प्रदान करता है।

जबकि बिना दाग वाली कोशिकाओं की एसआरएस इमेजिंग का उपयोग कई अध्ययनों के लिए किया गया है, जीवित कोशिकाओं की दीर्घकालिक समय-चूक एसआरएस इमेजिंग को व्यापक रूप से अपनाया नहीं गया है। एक कारण यह है कि वाणिज्यिक खुले कक्षों को उनकी बड़ी मोटाई9,10,11,12 के कारण एसआरएस इमेजिंग के लिए सीधे उपयोग नहीं किया जा सकता है। ग्लास ढक्कन वाले इन कक्षों को ज्यादातर एक बैकवर्ड डिटेक्शन स्कीम के साथ एकल उच्च एनए उद्देश्य का उपयोग करके ब्राइटफील्ड या फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि, एसआरएस इमेजिंग एक उच्च एनए उद्देश्य और उच्च एनए कंडेनसर दोनों का उपयोग करके प्रेषित पहचान पसंद करता है, जो उद्देश्य और कंडेनसर के बीच केवल एक बहुत कम अंतर (आमतौर पर कुछ मिलीमीटर) छोड़ देता है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने एक ईमानदार माइक्रोस्कोप फ्रेम का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं के टाइम-लैप्स एसआरएस इमेजिंग को सक्षम करने के लिए एक नरम सामग्री का उपयोग करके एक लचीला कक्ष तैयार किया। इस डिजाइन में, पानी को डुबोने के उद्देश्य को नरम कक्ष में संलग्न किया गया था और ध्यान केंद्रित करने और इमेजिंग उद्देश्यों के लिए तीन आयामों में स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ सकता है।

अधिकांश स्तनधारी कोशिकाओं के संवर्धन के लिए इष्टतम तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है, जबकि कमरे का तापमान हमेशा इससे 10 डिग्री कम होता है। 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक या कम तापमान सेल वृद्धि दर13 पर नाटकीय प्रभाव डालता है। इसलिए, लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम में सेल कल्चर वातावरण का तापमान नियंत्रण आवश्यक है। यह ज्ञात है कि तापमान अस्थिरता दीर्घकालिक इमेजिंग14 के दौरान डीफोकसिंग मुद्दों को जन्म देगी। एक स्थिर 37 डिग्री सेल्सियस वातावरण प्राप्त करने के लिए, हमने पूरे माइक्रोस्कोप फ्रेम को कवर करने के लिए एक बड़ा बाड़े कक्ष बनाया, जिसमें माइक्रोस्कोप के नीचे एक थर्मल इन्सुलेशन परत शामिल है (चित्रा 1)। बड़े तापमान नियंत्रण कक्ष के भीतर, छोटा लचीला कक्ष 5% सीओ 2 (चित्रा 2) के साथ पूरक विनियमित वायु प्रवाह के माध्यम से शारीरिक आर्द्रता और पीएच को सटीक रूप से बनाए रखने में मदद करता है। कक्षों के तापमान और आर्द्रता को यह पुष्टि करने के लिए मापा गया था कि डबल-चैंबर डिजाइन ने दीर्घकालिक, आवधिक एसआरएस इमेजिंग (चित्रा 3) के तहत सेल विकास के लिए इष्टतम सेल कल्चर स्थिति प्रदान की है। फिर हमने स्कोव 3 कैंसर कोशिकाओं (चित्रा 4, चित्रा 5, और चित्रा 6) में टाइम-लैप्स इमेजिंग और लिपिड बूंदों (एलडी) को ट्रैक करने के लिए सिस्टम के आवेदन का प्रदर्शन किया।

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Protocol

1. माइक्रोस्कोप पर्यावरण बाड़े का निर्माण

नोट: इस बड़े माइक्रोस्कोप पर्यावरण बाड़े का उपयोग माइक्रोस्कोप शरीर के तापमान को नियंत्रित करने और इमेजिंग वातावरण को 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 ए) पर स्थिर करने के लिए किया जाता है।

  1. ऑप्टिकल टेबल पर मार्कर पेन का उपयोग करके एसआरएस माइक्रोस्कोप फ्रेम और मोटराइज्ड स्टेज के पैरों के स्थानों को चिह्नित करें। माइक्रोस्कोप के गैल्वेनोमीटर स्कैनर के सामने दो आईरिस डायाफ्राम माउंट करें और पंप और स्टोक्स लेजर बीम को आईरिस डायाफ्राम के केंद्र से गुजरने के लिए समायोजित करें।
  2. ऑप्टिकल टेबल से माइक्रोस्कोप फ्रेम और स्टेज को हटा दें।
  3. ऑप्टिकल टेबल (चित्रा 1 बी) पर सिलिकॉन रबर शीट (आकार: 31 x 29 इंच, मोटाई: 1/8 इंच) बिछाएं।
  4. चाकू का उपयोग करके निशान के साथ सिलिकॉन रबर को काटें, छोटे रबर के टुकड़े हटा दें, और चौकोर एमआईसीए सिरेमिक शीट (आकार: 6 x 6 इंच, मोटाई: 1/4 इंच) को एक ही स्थान पर रखें।
    नोट: एमआईसीए सिरेमिक एक आसान-से-मशीन सामग्री15 है। यह एल्यूमीनियम के रूप में कठिन है लेकिन एक उत्कृष्ट थर्मल इन्सुलेटर है। एमआईसीए सिरेमिक शीट का उपयोग धातु माइक्रोस्कोप फ्रेम और स्टेज से स्टेनलेस-स्टील ऑप्टिकल टेबल तक गर्मी हस्तांतरण को रोकने के लिए किया गया था। फ्रेम और मंच के पैरों को ऊपर उठाने के लिए 1/4-20 स्क्रू के उपयोग की अनुमति देने के लिए एमआईसीए शीट्स पर कुछ थ्रू-होल ड्रिल किए जाने चाहिए।
  5. माइक्रोस्कोप फ्रेम और स्टेज को ऑप्टिकल टेबल पर वापस ले जाएं और मार्कर लाइनों के साथ एमआईसीए सिरेमिक शीट पर पैरों को सावधानीपूर्वक संरेखित करें। मेज पर फ्रेम और मंच को माउंट करने के लिए 1/4-20 स्क्रू का उपयोग करें।
  6. एसआरएस ऑप्टिकल पथ को पुन: संरेखित करें। मिरर 1 और मिरर 2 के दर्पण माउंट को समायोजित करें ताकि लेजर बीम दो प्रीमाउंटेड आईरिस डायाफ्राम (चित्रा 2) के केंद्र से गुजर सके।
    नोट: वर्तमान लाइव-सेल इमेजिंग कार्य के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रयोगशाला-निर्मित एसआरएस माइक्रोस्कोप के तकनीकी विवरण पहले16 वर्णित हैं। पंप और स्टोक्स बीम की पल्स चौड़ाई ग्लास रॉड फैलाव के साथ ~ 3-4 पीएस है। सिस्टम को ScanImage17 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके नियंत्रित किया जाता है।
  7. इस थर्मल इन्सुलेशन नींव के शीर्ष पर, बड़े पॉली कार्बोनेट शीट (आकार: 31 x 29 x 28 इंच, मोटाई: 0.25 इंच) के पांच टुकड़ों का उपयोग करके पूरे माइक्रोस्कोप फ्रेम को कवर करने के लिए पर्यावरणीय बाड़े को इकट्ठा करें।
    नोट: बाड़े बॉक्स का आकार माइक्रोस्कोप फ्रेम और चरण के आयामों के आधार पर निर्धारित किया जाता है। लचीले कक्ष को स्थापित करने और सेल कल्चर डिश को लोड करने के लिए माइक्रोस्कोप बाड़े बॉक्स के फ्रंट पैनल को अस्थायी रूप से हटाने की आवश्यकता होगी।
    1. बाड़े को इकट्ठा करने के लिए, पॉली कार्बोनेट शीट के प्रत्येक किनारे पर कटाई, ड्रिलिंग और टैपिंग स्क्रू छेद सहित सरल मशीनिंग कार्य करें। इनलेट और आउटलेट टयूबिंग को फिट करने के लिए बाड़े के दाएं और बाएं शीट पर 2.6 इंच के व्यास के साथ दो बड़े छेद ों को क्रमशः काटें। लेजर बीम को बाड़े में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए पीछे की शीट पर 5 मिमी के व्यास के साथ एक छोटा छेद काटें।
  8. एल्यूमीनियम पन्नी टेप का उपयोग करके बॉक्स के किनारों और इंटरफेस को सील करें।
  9. हीटर मॉड्यूल द्वारा पंप और नियंत्रित गर्म वायु प्रवाह की अनुमति देने के लिए लचीली वाहिनी नली को इनलेट और बाड़े के बॉक्स के आउटलेट पोर्ट से कनेक्ट करें। हीटर मॉड्यूल के थर्मल सेंसर को लचीले कक्ष में रखें जहां कोशिकाओं को सुसंस्कृत और चित्रित किया जाता है। लक्षित तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    नोट: पर्यावरणीय बाड़े में अधिक समान वायु प्रवाह वितरण प्राप्त करने के लिए एक डिफ्यूज़र का उपयोग किया जा सकता है।

2. लचीले कक्ष को इकट्ठा करें

  1. मशीन वाले खोखले बेलनाकार एल्यूमीनियम टुकड़े 1 (सामग्री: एल्यूमीनियम 6061) को तीन सेट स्क्रू (चित्रा 2) का उपयोग करके उद्देश्य के नाक के टुकड़े पर माउंट करें।
  2. मशीन वाले खोखले बेलनाकार एल्यूमीनियम टुकड़े 2 को चार 1/4-20 स्क्रू (चित्रा 2) का उपयोग करके नमूना धारक को माउंट करें।
    नोट: नमूना धारक को 50 मिमी कवर ग्लास-बॉटम सेल कल्चर डिश रखने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए। 1-7/8 इंच के छेद का उपयोग करके नमूना धारक के केंद्र में छेद के माध्यम से ड्रिल करें। 50 मिमी छेद का उपयोग करके छेद को काउंटरबोर करें और छेद की गहराई ~ 1 मिमी रखें।
  3. नमूना धारक को एल्यूमीनियम टुकड़ा 2 के साथ मोटर चालित मंच पर फिट करें और इसे स्क्रू का उपयोग करके माउंट करें।
  4. प्राकृतिक रबर फिल्म आस्तीन (मोटाई: 0.01 इंच; साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला के साथ चिपके हुए) को दो मशीनी एल्यूमीनियम टुकड़ों के बीच रखें और प्रत्येक छोर पर रबर बैंड का उपयोग करके इसे माउंट करें।
  5. संपीड़ित सीओ2 सिलेंडर को उचित ट्यूबिंग और कनेक्टर का उपयोग करके गैस मिक्सर मॉड्यूल से कनेक्ट करें। सीओ2 इनपुट दबाव को 20-25 पीएसआई पर सेट करें। एयर मिक्सर मॉड्यूल को विनियमित करने और एयरफ्लो में 5% सीओ 2 को विनियमित और मिश्रण करने के लिए एक अंतर्निहित सीओ2 सेंसर और एक नियंत्रक का उपयोग करें। एयरफ्लो को साफ करने के लिए इनलाइन फिल्टर का उपयोग करें।
  6. उचित ट्यूबिंग और कनेक्टर का उपयोग करके, गर्म प्लेट पर रखी गई प्रीस्टेरिलाइज्ड पानी की बोतल के लिए मिश्रित हवा (5% सीओ2 के साथ) का मार्गदर्शन करें, और फिर ह्यूमिडिफायर हवा को लचीले कक्ष में निर्देशित करें। गर्म प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। एयरफ्लो की आर्द्रता को बढ़ाने के लिए गर्म पानी में एयरफ्लो को बुलबुला करें।

3. टाइम-लैप्स लाइव-सेल एसआरएस इमेजिंग प्रयोगों की तैयारी

  1. लचीले कक्ष के सभी हिस्सों को 70% इथेनॉल के साथ पोंछें, जिसमें नाक का टुकड़ा, पानी की कमी का उद्देश्य और नमूना धारक शामिल हैं।
  2. 20 से 30 मिनट के लिए बाड़े में रखे यूवी लैंप का उपयोग करके पूरे एनक्लोजर सिस्टम को डिकॉन्टेमिनेट करें।
    नोट: सुरक्षा के लिए यूवी कीटाणुशोधन प्रक्रिया के दौरान प्रयोगशाला के कमरे में न रहें।
  3. एक नियमित इनक्यूबेटर में सामान्य शारीरिक परिस्थितियों में 12 घंटे के लिए 50-मिमी ग्लास-बॉटम पेट्री डिश में संस्कृति स्कोव 3 कोशिकाएं।
    नोट: एक मानक जैव सुरक्षा कैबिनेट में SKOV3 सेल संस्कृति18 प्रारंभ करें।
  4. स्क्रू को हटाकर नमूना धारक से मशीन एल्यूमीनियम टुकड़ा 2 को डिस्कनेक्ट करें।
    नोट: यह सेल कल्चर डिश को लोड करने के लिए लचीला कक्ष खोलने का तरीका है।
  5. सेल कल्चर डिश लोड करें। सेल कल्चर डिश रखने से पहले कंडेनसर के शीर्ष पर विसर्जन तेल जोड़ना याद रखें। पकवान के कवर को हटा दें और क्लैंप का उपयोग करके पकवान को स्थिर करें।
    नोट: संदूषण से बचने के लिए, सभी ऑपरेशन दस्ताने के साथ किया जाना चाहिए।
  6. मोटे फोकस के लिए सेल कल्चर मीडिया में उद्देश्य को कम करें। लचीले कक्ष को संलग्न करने के लिए एल्यूमीनियम टुकड़ा 2 को कम करें और इसे स्क्रू का उपयोग करके नमूना धारक को माउंट करें।
    नोट: अंतर को कसकर सील करने के लिए एल्यूमीनियम टुकड़े 2 के तल पर एक 2 मिमी सिलिकॉन रबर कुशन पैड जुड़ा हुआ है।
  7. 200 सीसी / मिनट की वायु प्रवाह दर के साथ सामान्य सेल कल्चर के लिए 5% सीओ 2 और 19% ओ2 के साथ वायु आपूर्ति सेट करें।
    नोट: कम वायु प्रवाह दर का उपयोग किया जा सकता है। यह इस बात पर निर्भर करता है कि लचीले कक्ष को कितनी अच्छी तरह सील किया गया है।

4. टाइम-लैप्स लाइव-सेल एसआरएस इमेजिंग प्रयोगों का संचालन करें।

  1. 2854 सेमी -1 रमन शिफ्ट को लक्षित करने के लिए लेजर तरंग दैर्ध्य को 805 एनएम तक ट्यून करें, जिसे सीएच2 रासायनिक बांड के कंपन के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। कोशिकाओं को फोटोडैमेज को कम करने के लिए कम लेजर पावर का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, लंबे समय तक लाइव-सेल इमेजिंग के लिए पंप लेजर की ~ 15 मेगावाट औसत शक्ति और स्टोक्स लेजर के ~ 7.5 एमडब्ल्यू (1,045 एनएम पर तय) का उपयोग करें।
    नोट: उच्च लेजर शक्ति बेहतर एसआरएस इमेजिंग गुणवत्ता प्राप्त करेगी। हालांकि, बहुत अधिक लेजर शक्ति जीवित कोशिकाओं को फोटोडैमेज प्रेरित करेगी। छवि की गुणवत्ता और फोटोडैमेज के बीच एक व्यापार है।
  2. सॉफ्टवेयर के मुख्य नियंत्रण पैनल पर फोकस बटन का उपयोग करके कोशिकाओं की अच्छी एसआरएस इमेजिंग प्राप्त करने के उद्देश्य को समायोजित और ध्यान केंद्रित करें। तेजी से फ़ोकस करने के लिए, कॉन्फ़िगरेशन पैनल पर 4.8 μs के पिक्सेल निवास समय के साथ पिक्सेल संख्या 512 × 512 पिक्सेल पर सेट करें।
  3. लॉक-इन एम्पलीफायर इनपुट रेंज (आमतौर पर 5 एमवी) को अधिकतम सिग्नल वोल्टेज से दोगुना सेट करें। लो-पास फ़िल्टर को पिक्सेल निवास समय (4.8 μs) के समान सेट करें।
    नोट: विभिन्न प्रयोगशाला-निर्मित एसआरएस सिस्टम विभिन्न डेटा अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग कर सकते हैं।
  4. अच्छा ध्यान केंद्रित करने के बाद, उच्च गुणवत्ता वाली छवियों के अधिग्रहण के लिए 175 μm 2 क्षेत्र के लिए इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन 2,048 × 2,048 पिक्सेल पर सेट करें। मुख्य नियंत्रण पैनल पर SAVE फ़ंक्शन की जाँच करें और चैनल पैनल पर SRS चैनल की जाँच करें। मुख्य नियंत्रण चैनल पर दो फ्रेम के बीच अंतराल समय 180 सेकंड (3 मिनट) सेट करें। 24 घंटे से अधिक टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए अधिग्रहण संख्या को 480 पर सेट करें।
    नोट: प्रयोगों के उद्देश्य के आधार पर एक कम इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन का उपयोग किया जा सकता है।
  5. मुख्य नियंत्रण पैनल पर लूप फ़ंक्शन का उपयोग करके स्वचालित इमेजिंग अधिग्रहण प्रारंभ करें।
    नोट: जांचें कि इमेजिंग के पहले घंटे में तापमान अस्थिरता के कारण फोकल बहाव है या नहीं। पहले घंटे की इमेजिंग स्थिर नहीं हो सकती है। टाइम-लैप्स इमेजिंग सत्र के दौरान हर 2-3 घंटे में ध्यान केंद्रित करने की जांच करें।
  6. इमेजजे19 का उपयोग करके एकत्र की गई छवियों को संसाधित करें। LD परिमाणीकरण के लिए निम्नलिखित दो विधियों का उपयोग करें: (i) LD/सेल बॉडी एरिया अनुपात, और (ii) कुल LD की औसत SRS तीव्रता। 2,854 सेमी-1 पर SRS छवियों में गैर-सेलुलर पिक्सेल को थ्रेशोल्ड और शून्य करके सेल बॉडी क्षेत्र को मापें। एसआरएस छवियों में गैर-एलडी पिक्सेल को थ्रेशोल्ड और शून्य करके एलडी क्षेत्र और तीव्रता को मापें।
    नोट: एसआरएस छवि प्रसंस्करण के बारे में अधिक जानकारी पहले16 बताई गई थी।

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Representative Results

हमने टाइम-लैप्स एसआरएस इमेजिंग (चित्रा 1 और चित्रा 2) के लिए लचीली कक्ष प्रणाली को गढ़ा और इकट्ठा किया, और फिर सिस्टम के प्रदर्शन का मूल्यांकन किया। माइक्रोस्कोप पर्यावरण बाड़े के अंदर का तापमान 1 घंटे के भीतर अपेक्षित 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया, जिसने कमरे के तापमान को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया (चित्रा 3 ए)। लचीले कक्ष में तापमान 1.5 घंटे में 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया, और इसे कम से कम 24 घंटे (चित्रा 3 बी) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रूप से बनाए रखा गया। लचीले कक्ष में सापेक्ष आर्द्रता 1 घंटे में 85% तक पहुंच सकती है, और फिर कम से कम 24 घंटे तक बनाए रखी जा सकती है (चित्रा 3 सी)। मापा तापमान और आर्द्रता डेटा पुष्टि करता है कि यह प्रणाली दीर्घकालिक सेल विकास के लिए एक इष्टतम वातावरण प्रदान कर सकती है।

एसआरएस के साथ लाइव-सेल इमेजिंग को कई जैविक और जैव चिकित्सा अध्ययनों20,21,22,23,24 पर लागू किया गया है। विशेष रूप से, कैंसर में लिपिड चयापचय को समझने के लिए जीवित कोशिकाओं में लेबल-मुक्त एलडी की एसआरएस इमेजिंग ने 16,25,26 पर बहुत ध्यान आकर्षित किया है। डिज़ाइन किए गए लचीले कक्ष प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने पहले 3 मिनट के समय अंतराल के साथ 24 घंटे के लिए लाइव स्कोव 3 कोशिकाओं की टाइम-लैप्स एसआरएस इमेजिंग का प्रदर्शन किया (चित्रा 4)। वीडियो डेटा ने 3 मिनट के अस्थायी संकल्प के साथ इंट्रासेल्युलर एलडी के तेजी से और सक्रिय आंदोलन को दिखाया। 24 घंटे के इमेजिंग सत्र के अंत तक, कोशिकाओं ने अभी भी सामान्य आकृति विज्ञान और घनत्व दिखाया, यह दर्शाता है कि कोशिकाएं स्वस्थ थीं। फिर हमने ओलिक एसिड (ओए) के साथ इलाज किए गए स्कोव 3 कोशिकाओं को चित्रित किया और 10 घंटे के भीतर एलडी संचय की गतिशील प्रक्रिया को ट्रैक किया (चित्रा 5 ए)।

इमेजजे19 का उपयोग करके ओए-उपचारित एसकेओवी 3 कोशिकाओं में एलडी मात्रा को दो तरीकों (एलडी से सेल बॉडी एरिया अनुपात और एलडी की कुल एसआरएस तीव्रता) में निर्धारित किया गया था। परिणाम बताते हैं कि एलडी की मात्रा (आकार और संख्या में) 10 घंटे से अधिक बढ़ती रही (चित्रा 5 बी)। हमने फ्लोरेसेंस डाई डीएनडी -189 (चित्रा 6) के साथ लेबल किए गए लाइसोसोम (छद्म रंग लाल) के एलडी (छद्म रंग हरे) और बैकवर्ड टू-फोटॉन फ्लोरेसेंस (टीपीएफ) इमेजिंग के एक साथ फॉरवर्ड-एसआरएस इमेजिंग का भी प्रदर्शन किया। यह ध्यान दिया जाता है कि एसआरएस / टीपीएफ दोहरी-साधन इमेजिंग का उपयोग दो सेलुलर डिब्बों के कोलोकलाइजेशन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रयोग में, एलडी और लाइसोसोम के कोलोकलाइजेशन की बहुत कम डिग्री देखी गई, जिसे छोटे पीले क्षेत्रों द्वारा इंगित किया गया था। सामूहिक रूप से, इन परिणामों से पता चलता है कि लचीली कक्ष प्रणाली जीवित कोशिकाओं के स्थिर, दीर्घकालिक, समय-चूक एसआरएस इमेजिंग को सक्षम करती है, जिसका उपयोग भविष्य में विभिन्न इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: जीवित कोशिकाओं के टाइम-लैप्स एसआरएस इमेजिंग के लिए लचीली कक्ष प्रणाली। (ए) जीवित कोशिकाओं के टाइम-लैप्स एसआरएस इमेजिंग के लिए लचीली कक्ष प्रणाली का योजनाबद्ध। (बी) बाईं ओर की छवि माइक्रोस्कोप फ्रेम और मंच के नीचे सिलिकॉन रबर शीट और एमआईसीए सिरेमिक पैड का उपयोग करके थर्मल इन्सुलेशन परत दिखाती है। दाईं ओर की छवि पर्यावरण माइक्रोस्कोप बाड़े और लचीले कक्ष को दिखाती है। संक्षेप: एसआरएस = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन; सीसीएम = घन सेंटीमीटर प्रति मिनट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एसआरएस ऑप्टिकल पथ के साथ लचीले कक्ष की योजनाबद्ध और छवियां, ध्यान केंद्रित करने और इमेजिंग के लिए पानी के डिपिंग उद्देश्य के त्रि-आयामी मुक्त आंदोलन की अनुमति देती हैं। बाईं छवियां दो मशीनीकृत एल्यूमीनियम मॉड्यूल दिखाती हैं जो एक वाणिज्यिक उद्देश्य नाक के टुकड़े और एक संशोधित नमूना धारक से जुड़े हैं। नीचे की छवियां असेंबली फ्लेक्सिबल चैंबर सिस्टम दिखाती हैं। संक्षिप्त नाम: एसआरएस = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: माइक्रोस्कोप बाड़े और लचीले कक्ष का तापमान और आर्द्रता डेटा। (A) माइक्रोस्कोप बाड़े का मापा तापमान डेटा और प्रयोगशाला के कमरे का तापमान, 12 घंटे तक। (B) लचीले कक्ष के भीतर मापा गया तापमान डेटा (औसत 37 डिग्री सेल्सियस पर), 24 घंटे तक। (C) लचीले कक्ष के भीतर मापा सापेक्ष आर्द्रता डेटा (औसत 85%) 24 घंटे तक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: टाइम-लैप्स एसआरएस इमेजिंग के प्रतिनिधि 24 फ्रेम। लचीले कक्ष का उपयोग करके लाइव स्कोव 3 कोशिकाओं की टाइम-लैप्स एसआरएस इमेजिंग (2,854 सेमी -1 पर), 24 घंटे तक। इस प्रयोग में, 3 मिनट के निश्चित समय अंतराल के साथ 480 फ्रेम दर्ज किए गए थे। कोशिकाओं को सामान्य परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया गया था। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: टाइम-लैप्स एसआरएस इमेजिंग और लिपिड ड्रॉपलेट परिमाणीकरण। (ए) लचीले कक्ष का उपयोग करके 10 घंटे तक 500 μM OA के साथ इलाज किए गए लाइव SKOV3 कोशिकाओं के टाइम-लैप्स एसआरएस इमेजिंग (2,854 सेमी -1 पर) के प्रतिनिधि 10 फ्रेम। इस प्रयोग में, 3 मिनट के निश्चित समय अंतराल के साथ 200 फ्रेम दर्ज किए गए थे। स्केल बार = 50 μm. (B) LDs बनाम समय (0-10 h) की मात्रा को थ्रेशोल्डिंग फ़ंक्शन और ImageJ में कण विश्लेषण कार्यों का उपयोग करके दो तरीकों (LD/सेल बॉडी एरिया अनुपात और LDs की कुल SRS तीव्रता) में निर्धारित किया गया था। संक्षेप: एसआरएस = उत्तेजित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी; ओए = ओलिक एसिड; एलडी = लिपिड बूंदें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एलडी और लाइसोसोम के लिए समय-चूक, एक साथ एसआरएस और दो-फोटॉन फ्लोरेसेंस इमेजिंग। समय-व्यपगत, एक साथ एसआरएस (2,854 सेमी -1 पर), और एलडी (छद्म रंग हरा) और लाइसोसोम (लाल) के लिए दो-फोटॉन फ्लोरेसेंस इमेजिंग, 2 घंटे तक। इमेजिंग से पहले 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को फ्लोरेसेंस डाई (लाइसोसेंसर डीएनडी -189, 1 μM) के साथ इलाज किया गया था। तस्वीरें हर 3 मिनट में ली जाती हैं। स्केल बार = 50 μm। एलडी और लाइसोसोम के कोलोकलाइजेशन की एक कम डिग्री देखी गई, जो पीले रंग के साथ इंगित की गई थी। संक्षेप: एसआरएस = उत्तेजित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी; एलडी = लिपिड बूंदें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

टाइम-लैप्स लाइव-सेल एसआरएस माइक्रोस्कोपी लेबल-फ्री तरीके से अणु ट्रैकिंग के लिए एक वैकल्पिक इमेजिंग तकनीक है। प्रतिदीप्ति लेबलिंग की तुलना में, एसआरएस इमेजिंग फोटोब्लीचिंग से मुक्त है, जिससे अणुओं की दीर्घकालिक निगरानी सक्षम होती है। हालांकि, आज तक, एक ईमानदार एसआरएस माइक्रोस्कोपी पर लाइव सेल इमेजिंग सिस्टम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है। इस काम में, प्रेषित एसआरएस टाइम-लैप्स इमेजिंग को सक्षम करने के लिए एक स्थिर थर्मल-इंसुलेटेड माइक्रोस्कोप एनक्लोजर बॉक्स और एक लचीला आंतरिक नरम कक्ष के साथ एक लाइव सेल इमेजिंग सिस्टम विकसित किया गया था। इस सेटअप में, बड़ा बाड़े का बॉक्स 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान स्थिरता बनाए रखता है, जबकि आंतरिक नरम कक्ष एक इष्टतम सेल संस्कृति वातावरण स्थापित करने के लिए ह्यूमिडिफायर हवा की आपूर्ति करता है। इस काम में प्रदर्शित लचीला खुला कक्ष जीवित कोशिकाओं के दीर्घकालिक एसआरएस इमेजिंग के लिए एक सरल वर्कफ़्लो सक्षम बनाता है। ग्लास-बॉटम डिश में बीजित कोशिकाओं को इमेजिंग के लिए लचीले ऑन-स्टेज चैंबर में स्थानांतरित करने से पहले एक नियमित इनक्यूबेटर में तैयार और सुसंस्कृत किया जा सकता है। लाइव-सेल एसआरएस इमेजिंग करने के लिए एक वैकल्पिक समाधान एक बंद प्रवाह सेल का उपयोग करना है, जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक और फ्लो साइटोमेट्री प्लेटफॉर्म27,28,29,30 शामिल हैं। कम मोटाई के साथ एक प्रवाह सेल डिजाइन करना संभव है। हालांकि, एक छिड़काव कक्ष में कोशिकाओं का संवर्धन तकनीकी रूपसे चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

लाइव-सेल इमेजिंग32 में फोकल बहाव एक आम मुद्दा है। एक मल्टीफोटॉन प्रक्रिया के रूप में, एसआरएस सिग्नल जनरेशन को लेजर बीम के कसकर ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता होती है और इसलिए, एसआरएस माइक्रोस्कोपी फोकल बहाव के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है। तापमान अस्थिरता फोकल बहाव को प्रेरित करने में एक आवश्यक कारक है। थर्मल स्थिरता में सुधार करने के लिए, पूरे माइक्रोस्कोप को थर्मल इन्सुलेट सामग्री के साथ संलग्न किया गया था। हालांकि, कुछ इमेजिंग सत्रों में, हमने अभी भी इमेजिंग के 2-3 घंटे के बाद फोकल बहाव का अनुभव किया। एसआरएस माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग भी कंपन के प्रति संवेदनशील है, जो ध्यान केंद्रित करने को नष्ट कर सकता है। एक एंटी-कंपन ऑप्टिकल टेबल स्थिर इमेजिंग प्राप्त करने के लिए कंपन को कम करने में मदद करता है। फोकल ड्रिफ्ट समस्या को हल करने के लिए, भविष्य के प्रयोगों में, ऑटोफोकसप्रौद्योगिकियों को अपनाया जा सकता है।

इमेजिंग सिस्टम की कीटाणुशोधन प्रक्रिया कोशिकाओं के संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से जल विसर्जन उद्देश्य के लिए, जो सीधे सेल कल्चर मीडिया से संपर्क करेगी। लेंस टॉप सफाई के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करना सुरक्षित होना चाहिए। क्योंकि यूवी प्रकाश केवल वस्तुओं की सतह को प्रभावी ढंग से कीटाणुरहित कर सकता है, इन प्रयोगों में कीटाणुशोधन करने के लिए बाड़े के बॉक्स में विभिन्न स्थानों पर चार यूवी लैंप लगाए गए थे। हालांकि, यूवी प्रकाश इमेजिंग सिस्टम में प्लास्टिक घटकों को नीचा दिखा सकता है। इस मामले में, प्लास्टिक भागों को लपेटने और कवर करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग किया जा सकता है। लाइव-सेल इमेजिंग के लिए, एंटीबायोटिक्स (आमतौर पर पेनिसिलिन की 100 इकाइयों / एमएल और संस्कृति मीडिया में स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / mL) की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।

हमने इन प्रयोगों में जीवित कैंसर कोशिकाओं में एलडी की छवि और मात्रा निर्धारित की। इन प्रयोगों के लिए, 3 मिनट का समय अंतराल उचित था। यह ध्यान दिया जाता है कि अनुसंधान परियोजना की जरूरतों के आधार पर इमेजिंग समय अंतराल को बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक लाइव सेल में एकल एलडी को ट्रैक करने के लिए, 1 मिनट से कम समय अंतराल की आवश्यकता हो सकती है। इसके विपरीत, धीमीजैविक प्रक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए कुछ मिनटों का लंबा समय अंतराल पर्याप्त है।

एसआरएस इमेजिंग कई अन्य ऑप्टिकल इमेजिंग प्रौद्योगिकियों की तुलना में उत्तेजना के लिए उच्च लेजर शक्ति का उपयोग करता है, जो जीवित कोशिकाओं के दीर्घकालिक समय-चूक एसआरएस इमेजिंग के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। देशी बायोमोलेक्यूल्स की एसआरएस इमेजिंग रासायनिक बांड35 के छोटे रमन क्रॉस-सेक्शन के कारण और भी चुनौतीपूर्ण है। इन प्रयोगों में, 805 एनएम पर 15 मेगावाट पंप लेजर और 1,045 एनएम पर 7.5 एमडब्ल्यू स्टोक्स लेजर का उपयोग किया गया था, और 3 मिनट के समय अंतराल के साथ 24 घंटे में कोई महत्वपूर्ण फोटोडैमेज नहीं देखा गया था। संवेदनशील रमन टैग का उपयोग लेजर शक्तिको और कम कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम माइक्रोस्कोप बाड़े के बॉक्स के डिजाइन, निर्माण और परीक्षण के लिए बिंघमटन विश्वविद्यालय में 2019 अंडरग्रेजुएट सीनियर डिज़ाइन टीम (सुक चुल यून, इयान फॉक्सटन, लुई माज़ा और जेम्स वाल्श) को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम सहायक चर्चाओं के लिए बिंघमटन विश्वविद्यालय में स्कॉट हैनकॉक, ओल्गा पेत्रोवा और फैबिओला मोरेनो ओलिवास को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को पुरस्कार संख्या आर 15 जीएम 140444 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A lab-built SRS microscope https://rdcu.be/cP6ve
HF2LI 50 MHz lock-in amplifer Zurich Instruments HF2LI
Iris diaphragm Thorlabs Inc SM1D12
Kinematic mirror mount Thorlabs Inc KM100
Microscope frame Nikon Inc FN-1
Motorized microscopy stage Prior Scientific Z-Deck
Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) Nikon Inc MBL71405
Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) Nikon Inc MRD77225
Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H)
Airtherm heater module World Precision Instruments (WPI) AIRTHERM-SAT-1W
Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor World Precision Instruments (WPI) AIRTHERM-SMT-1W
Air/CO2 mixer module World Precision Instruments (WPI) ECU-HOC-W
Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) McMaster-Carr 56675K71
High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) McMaster-Carr 8489K62
Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') McMaster-Carr 8574K286
Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') McMaster-Carr 5827T43
Materials and parts for the Flexible chamber
Hot plate McMaster-Carr 31745K11
High-purity inline filter, 1/4 NPT McMaster-Carr 6645T18
Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) McMaster-Carr 4066A34
Hole saw (cutting diameter 50 mm) McMaster-Carr 4556A19
High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD McMaster-Carr 5054K313
Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) McMaster-Carr 98385K843
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) McMaster-Carr 9056K42
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) McMaster-Carr 9056K47
Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') McMaster-Carr 8975K142
Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') McMaster-Carr 9246K21
Objective nosepiece (single) Nikon Inc FN-MN-H
Sample holder (modified) Prior Scientific HZ202
Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') McMaster-Carr 8611K13
Vacuum-sealable glass jar McMaster-Carr 3231T44
Software
MATLAB MathWorks
ImageJ (Fiji) imagej.net
ScanImage Vidrio Technologies, LLC SRS imaging software
Materials for live-cell imaging
Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) Electron Microscopy Sciences (EMS) 70674-02
DMEM cell culture medium ThermoFisher Scientific 11965092
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 26140079
LysoSensor fluorescent dye DND-189 ThermoFisher Scientific L7535 (Invitrogen)
Oleic acid MilliporeSigma 364525
SKOV3 cell line ATCC HTB-77

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References

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रिट्रेक्शन इश्यू 186 फ्लेक्सिबल चैंबर लाइव-सेल इमेजिंग टाइम-लैप्स उत्तेजित रमन स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी लिपिड ड्रॉपलेट्स कैंसर लिपिड मेटाबोलिज्म।
उत्तेजित रमन स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी के साथ टाइम-लैप्स लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक लचीला कक्ष
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Yuan, Y., Lu, F. A Flexible Chamber… More

Yuan, Y., Lu, F. A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (186), e64449, doi:10.3791/64449 (2022).

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