Infraroodthermografie voor de detectie van veranderingen in de activiteit van bruin vetweefsel

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het meten van bruine vetweefselactiviteit na een maaltijd bij mensen en proefdieren.

Abstract

Het meten van bruin vetweefsel (BAT) activiteit door positron emissie tomografie computertomografie (PET-CT) via de accumulatie van ¹⁸F-fluorodeoxyglucose (FDG) na een maaltijd of bij zwaarlijvige of diabetische patiënten faalt als de methode van keuze. De belangrijkste reden is dat ¹⁸F-FDG concurreert met de postprandiale hoge glucoseplasmaconcentratie voor dezelfde glucosetransporter op het membraan van BAT-cellen. Bovendien gebruikt BAT vetzuren ook als energiebron, wat niet zichtbaar is met PET-CT en kan worden veranderd samen met de glucoseconcentratie bij zwaarlijvige en diabetespatiënten. Om het fysiologische belang van BBT bij dieren en mensen te schatten, wordt daarom een nieuwe infraroodthermografiemethode toegepast die in recente publicaties wordt gebruikt.

Na ‘s nachts vasten werd de BAT-activiteit gemeten door infraroodthermografie voor en na een maaltijd bij menselijke vrijwilligers en vrouwelijke wild-type muizen. De camerasoftware berekent de temperatuur van het object op basis van de afstand tot het object, de emissiviteit van de huid, de gereflecteerde kamertemperatuur, de luchttemperatuur en de relatieve vochtigheid. Bij muizen was het geschoren gebied boven de BBT een interessant gebied waarvoor gemiddelde en maximale temperaturen werden gemeten. De fase van de oestruscyclus bij vrouwelijke muizen werd bepaald na een experiment met vaginale uitstrijkjes gekleurd met cresylviolet (0,1%) vlekoplossing. Bij gezonde vrijwilligers werden twee huidgebieden van de nek geselecteerd: het supraclaviculaire gebied (boven het sleutelbeen, waar BAT-cellen aanwezig zijn) en het interclaviculaire gebied (tussen de sleutelbeenderen, waar geen BAT-weefsel is gedetecteerd). De BBT-activiteit wordt bepaald door de aftrekking van deze twee waarden. Ook konden de gemiddelde en maximale temperaturen van huidgebieden worden bepaald bij dieren en menselijke deelnemers.

Veranderingen in BBT-activiteit na een maaltijd gemeten met infraroodthermografie, een niet-invasieve en meer gevoelige methode, bleken afhankelijk te zijn van geslacht, leeftijd en fase van de oestruscyclus bij proefdieren. Als onderdeel van door voeding geïnduceerde thermogenese is ook bewezen dat BAT-activering bij mensen afhankelijk is van geslacht, leeftijd en body mass index. Het verder bepalen van de pathofysiologische veranderingen in BAT-activiteit na een maaltijd zal van groot belang zijn voor deelnemers met hoge glucoseplasmaconcentraties (obesitas en diabetes mellitus type 2), evenals bij verschillende proefdieren (knock-out muizen). Deze methode is ook een variabel hulpmiddel voor het bepalen van mogelijke activerende geneesmiddelen die de BAT-activiteit kunnen verjongen.

Introduction

Bruin vetweefsel (BAT) slaat, in tegenstelling tot wit vetweefsel (WAT), geen energie op, maar besteedt er juist energie aan. Bij sympathische stimulatie maakt BAT gebruik van vetzuren en glucose en produceert warmte door de activering van ontkoppelend eiwit 1 (UCP1). De functie van UCP1 is om een H ⁺ -gradiënt tussen twee mitochondriale membranen te gebruiken om warmte te produceren in plaats van ATP. De functie van BBT is het verhogen van de warmteproductie onder koude omstandigheden, wat leidt tot een toename van het energieverbruik¹. Na blootstelling aan koude remmen sensorische inputs van de huid warmgevoelige neuronen in de mediane preoptische (MnPO) kern van het hypothalamische preoptische gebied (POA), wat het remmende effect van POA-neuronen op de rostrale raphe pallidus (rRPa) vermindert. De activering van rRPa-neuronen verhoogt de sympathische activiteit, gevolgd door een toename van de BBT-activiteit ^2,3. Door koude geïnduceerde BAT-activering verbetert de insulinegevoeligheid bij mensen⁴, en deze activiteit is afgenomen bij mensen met een verhoogde body mass index (BMI) en een leeftijd^van 1,5,6,7.

Afgezien van zijn rol in koude-geïnduceerde thermogenese, neemt de glucoseopname in de BAT na een maaltijd toe in de magere mannelijke populatie, wat bijdraagt aan door voeding geïnduceerde thermogenese (DIT), die hoger is bij BAT-positieve mannelijke proefpersonen ^8,9. De state-of-the-art techniek die wordt gebruikt voor het meten van BBT-activiteit is positronemissietomografie computertomografie, bekend als PET-CT. Deze methode bepaalt de BBT-activiteit door de accumulatie van de radiotracer fluorodeoxyglucose (¹⁸F-FDG) te meten. PET-CT faalt echter als de voorkeursmethode voor het detecteren van de activering van BBT na een maaltijd. Een van de redenen is dat, na een maaltijd, ¹⁸F-FDG concurreert met postprandiale hyperglycemie voor dezelfde glucosetransporter, waardoor het ongeschikt is voor het bepalen van BAT-activering na een maaltijd, vooral bij het vergelijken van BAT-activiteit bij gezonde en diabetische deelnemers met mogelijke verschillen in bloedglucoseconcentraties. Bovendien gebruikt de BBT vetzuren als energiebron voor warmteproductie die niet zichtbaar is met PET-CT. ¹⁸ F-FDG accumulatie in BAT na een maaltijd is nauwelijks zichtbaar¹⁰ en wordt daarom in de meeste gevallen geïnterpreteerd als een negatief resultaat. Het is niet verwonderlijk dat onlangs werd gesuggereerd dat de activering van BBT meer uitgesproken is in de menselijke populatie dan we eerder hadden gedacht; daarom is een nieuwe aanpak nodig om BBT-activiteit en de betrokkenheid ervan bij metabole stoornissen te detecteren⁷. Een poging om dit probleem op te lossen is het meten van het volume van BAT met magnetische resonantie beeldvorming (MRI) bij prediabetische patiënten en patiënten met diabetes mellitus type 2 (T2DM) met insulineresistentie¹¹. Het BBT-volume gemeten met MRI is echter geen voldoende indicator voor het schatten van de dagelijkse functie en het gebruik van glucose en vetzuren door BAT. Om echte verschillen in BAT-activiteit bij gezonde versus T2DM-patiënten te schatten, is daarom een nieuwe aanpak nodig die een mogelijkheid biedt om het pathologische mechanisme van BAT-storing bij T2DM-patiënten te achterhalen.

Om de activering van BBT te bepalen, hebben we metingen van BBT-warmteproductie voor en na een maaltijd uitgevoerd met behulp van infrarood (IR) thermografie (figuur 1^)12,13. Het vaststellen van IR-thermografie als een voorkeursmethode voor het meten van BAT-activiteit na een maaltijd bij gezonde en zwaarlijvige personen of patiënten met diabetes mellitus zal een enorme impact hebben op het veld. Tot op de dag van vandaag wordt IR-thermografie gebruikt voor de bepaling van koude-geïnduceerde activering van BBT^13,14,15. In de recente menselijke geschiedenis is koude-geïnduceerde BBT-activiteit niet erg uitgesproken meer (als gevolg van de juiste verwarming van habitats, goede kleding), terwijl BBT-activering na een maaltijd elke dag plaatsvindt. Bovendien is de fysiologische regulatie van deze twee BBT-functies via de hypothalamus totaal verschillend. Na een maaltijd leidt de activering van proopiomelanocortine (POMC)-tot expressie brengende neuronen in de hypothalamusboogkern (Arc) tot een toename van de sympathische zenuwactiviteit via rRPa¹⁶. Koude-geïnduceerde activering van BBT gemeten door IR-thermografie of PET-CT is onjuist wanneer het wordt gebruikt als een maat voor dagelijkse BBT-activiteit. Verhoogde BAT-activiteit na een maaltijd wordt gevolgd door glucosegebruik, wat uiteindelijk belangrijk is voor het handhaven van glucosehomeostase, insulinegevoeligheid en de dagelijkse regulatie van glucoseconcentratie. Postprandiale BBT-activering leidt tot een toename van het postprandiale glucoseverbruik, gevolgd door een toename van de warmteproductie en lichaamstemperatuur (DIT). Dit bleek geslachts-, leeftijds- en BMI-afhankelijk^{te zijn 12}. Vergelijkbare geslachtsverschillen in BAT-activering na een maaltijd worden waargenomen bij mannelijke en vrouwelijke laboratoriummuizen¹⁷. Deze bevindingen komen overeen met recent ontdekte geslachtsverschillen in de regulatie van BAT door Burke et al., die aantoonden dat de hypothalamische regulatie van BAT browning via een subpopulatie van POMC-neuronen verschilt bij mannelijke en vrouwelijke muizen¹⁸. De postprandiale activering van BAT is kleiner bij vrouwen, oudere populaties en zwaarlijvige mensen. Het ontbreken van BAT-activering na een maaltijd (verminderd glucosegebruik) kan leiden tot een hogere prevalentie van verminderde glucosetolerantie bij vrouwen 19,20,21,22. Helaas werden de meeste onderzoeken naar BAT-activering alleen bij mannen uitgevoerd. Door BAT na een maaltijd te activeren, neemt de glucoseopname toe in de magere mannelijke populatie. Het is niet verwonderlijk dat, na BAT-activering, DIT hoger is bij BAT-positieve mannelijke proefpersonen ^8,9. Bovendien verbetert BAT-transplantatie bij mannelijke muizen de glucosetolerantie, verhoogt het de insulinegevoeligheid en vermindert het lichaamsgewicht en de vetmassa²³.

PET-CT faalt als voorkeursmethode voor het meten van BBT-activiteit, vooral na een maaltijd. Daarom werd een niet-invasieve en meer gevoelige methode ontwikkeld. IR-thermografie maakt het mogelijk om de BBT-activiteit te schatten bij verschillende proefdieren (knock-out muizen) en bij menselijke deelnemers, ongeacht geslacht, leeftijd of de effecten van verschillende pathologische aandoeningen op de BBT-activiteit. Een bijkomend voordeel van deze methode is de eenvoud voor deelnemers en proefdieren, waardoor we de potentiële voordelen van BAT-boostertherapie kunnen inschatten. De recente studies met behulp van IR-thermografie voor het bepalen van het fysiologische gedrag van BAT na blootstelling aan koude of een maaltijd worden beschreven in de recente publicatie van Brasil et ^al.24.

Protocol

Alle experimentele procedures voor proefdieren zijn goedgekeurd door het Nationaal Ethisch Comité en het ministerie van Landbouw (EP 185/2018). De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische codex van de Kroatische vereniging voor proefdierwetenschap en de ARRIVE-richtlijnen. Alle procedures uitgevoerd in studies met menselijke deelnemers waren in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Universiteit van Zagreb, School of Medicine (UP / I-322-0…

Representative Results

De eenvoudigste manier om de BBT-activiteit te bepalen, is door de maximale huidtemperatuur boven de BBT voor en na een maaltijd bij menselijke proefpersonen af te trekken. Een betere manier om de BBT-activiteit te berekenen, is door twee gebieden van belang te selecteren: het huidgebied boven de BBT, dat zich in het supraclaviculaire gebied bevindt, en het interclaviculaire gebied van de huid waar geen BBT-weefsel bij mensen wordt aangetroffen, aangewezen als referentiegebied (volgens PET-CT; Figuur…

Discussion

Recente studies presenteren groeiend bewijs met betrekking tot de fysiologische regulatie en het belang van BAT-activiteit bij volwassen mensen en dieren bij de ontwikkeling van obesitas en diabetes mellitus. Bovendien wordt mogelijke BBT-activering door exogene activatoren een doelwit voor farmaceutische bedrijven. Om de fysiologische regulatie en het pathofysiologische belang van BAT bij zeer belastende ziekten te kunnen inschatten en een potentiële therapeutische benadering te kunnen ontdekken, wordt infraroodthermog…

Materials

0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020