Termografia infravermelha para detecção de alterações na atividade do tecido adiposo marrom

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade do tecido adiposo marrom após uma refeição em humanos e animais de laboratório.

Abstract

A mensuração da atividade do tecido adiposo marrom (BAT) por tomografia por emissão de pósitrons (PET-CT) via acúmulo de ¹⁸F-fluordesoxiglicose (FDG) após uma refeição ou em pacientes obesos ou diabéticos falha como método de escolha. A principal razão é que ¹⁸F-FDG compete com a alta concentração plasmática de glicose pós-prandial pelo mesmo transportador de glicose na membrana das células BAT. Além disso, a MTD também utiliza ácidos graxos como fonte de energia, o que não é visível com o PET-CT e pode ser alterado juntamente com a concentração de glicose em pacientes obesos e diabéticos. Portanto, para estimar a importância fisiológica das MTD em animais e humanos, um novo método de termografia infravermelha utilizado em publicações recentes é aplicado.

Após jejum noturno, a atividade da MTD foi medida por termografia infravermelha antes e depois de uma refeição em voluntários humanos e camundongos fêmeas selvagens. O software da câmera calcula a temperatura do objeto usando a distância do objeto, a emissividade da pele, a temperatura ambiente refletida, a temperatura do ar e a umidade relativa. Em camundongos, a área raspada acima da MTD foi uma região de interesse para a qual as temperaturas médias e máximas foram medidas. A fase do ciclo estral em ratas foi determinada após experimento por esfregaço vaginal corado com cresilvioleta (0,1%) corado com solução corada com violeta de cresil. Em voluntários saudáveis, duas áreas de pele do pescoço foram selecionadas: a área supraclavicular (acima da clavícula, onde as células MTD estão presentes) e a área interclavicular (entre as clavículas, onde não há tecido MTD detectado). A atividade MTD é determinada pela subtração desses dois valores. Além disso, as temperaturas média e máxima das áreas da pele puderam ser determinadas em animais e participantes humanos.

As mudanças na atividade das MTD após uma refeição medida por termografia infravermelha, um método não invasivo e mais sensível, mostraram ser dependentes de sexo, idade e fase do ciclo estral em animais de laboratório. Como parte da termogênese induzida pela dieta, a ativação de MTD em humanos também provou ser dependente de sexo, idade e índice de massa corporal. Determinar ainda mais as alterações fisiopatológicas na atividade da MTD após uma refeição será de grande importância para participantes com altas concentrações plasmáticas de glicose (obesidade e diabetes mellitus tipo 2), bem como em diferentes animais de laboratório (camundongos knock-out). Este método também é uma ferramenta variável para determinar possíveis drogas ativadoras que poderiam rejuvenescer a atividade da BAT.

Introduction

O tecido adiposo marrom (BAT), em contraste com o tecido adiposo branco (TAB), não armazena, mas gasta energia. Após estimulação simpática, a MTD utiliza ácidos graxos e glicose e produz calor pela ativação da proteína desacopladora 1 (UCP1). A função da UCP1 é usar um gradiente de H⁺ entre duas membranas mitocondriais para produzir calor em vez de ATP. A função das MTD é aumentar a produção de calor em condições frias, o que leva a um aumento do gasto energético¹. Após a exposição ao frio, as entradas sensoriais da pele inibem os neurônios sensíveis ao calor no núcleo pré-óptico mediano (MnPO) da área pré-óptica hipotalâmica (POA), o que diminui o efeito inibitório dos neurônios POA sobre o rostral raphe pallidus (rRPa). A ativação dos neurônios rRPa aumenta a atividade simpática, que é acompanhada por um aumento na atividade da MTD ^2,3. A ativação do BAT induzida pelo frio melhora a sensibilidade à insulina em humanos⁴, e essa atividade é diminuída em humanos com aumento do índice de massa corporal (IMC) e idade 1,5,6,7.

Além de seu papel na termogênese induzida pelo frio, após uma refeição, a captação de glicose no MTD aumenta na população masculina magra, contribuindo para a termogênese induzida pela dieta (DIT), que é maior em indivíduos do sexo masculino positivos para MTD ^8,9. A técnica de ponta utilizada para medir a atividade da MTD é a tomografia computadorizada por emissão de pósitrons, conhecida como PET-CT. Este método determina a atividade MTD medindo o acúmulo do radiotraçador fluordesoxiglicose (¹⁸F-FDG). No entanto, a PET-CT falha como método de escolha para detectar a ativação da MTD após uma refeição. Uma das razões é que, após uma refeição, ¹⁸F-FDG compete com a hiperglicemia pós-prandial pelo mesmo transportador de glicose, o que o torna inadequado para determinar a ativação da MTD após uma refeição, especialmente quando se compara a atividade da MTD em participantes saudáveis e diabéticos com possíveis diferenças nas concentrações de glicose no sangue. Além disso, a MTD utiliza ácidos graxos como fonte de energia para a produção de calor, o que não é visível com o PET-CT. ^18º O acúmulo de F-FDG nas MTD após uma refeição é pouco visível¹⁰ e, portanto, é interpretado como um resultado negativo na maioria dos casos. Sem surpresa, recentemente, foi sugerido que a ativação da MTD é mais pronunciada na população humana do que pensávamos anteriormente; portanto, uma nova abordagem para detectar a atividade da MTD e seu envolvimento em distúrbios metabólicos é necessária⁷. Uma tentativa de solucionar esse problema é medir o volume das MTD por meio de ressonância magnética (RM) em pacientes pré-diabéticos e portadores de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) com resistência insulínica¹¹. No entanto, o volume de MTD medido pela RM não é um indicador suficiente para estimar a função diária e o uso de glicose e ácidos graxos pela BAT. Portanto, para estimar diferenças reais na atividade da MTD em pacientes saudáveis versus com DM2, é necessária uma nova abordagem que ofereça a possibilidade de descobrir o mecanismo patológico do mau funcionamento da MTD em pacientes com DM2.

Para determinar a ativação da BAT, foram realizadas medidas da produção de calor MTD antes e após uma refeição utilizando termografia infravermelha (IR) (Figura 1)^12,13. Estabelecer a termografia IR como um método de escolha para medir a atividade das MTD após uma refeição em indivíduos saudáveis e obesos ou pacientes com diabetes mellitus terá um enorme impacto no campo. Até hoje, a termografia IR é utilizada para a determinação da ativação induzida pelo frio da MTD^13,14,15. Na história humana recente, a atividade BAT induzida pelo frio não é mais muito pronunciada (devido ao aquecimento adequado dos habitats, roupas adequadas), enquanto a ativação das MTD após uma refeição ocorre todos os dias. Além disso, a regulação fisiológica destas duas funções MTD através do hipotálamo é completamente diferente. Após uma refeição, a ativação de neurônios que expressam proopiomelanocortina (POMC) no núcleo arqueado hipotalâmico (Arc) leva a um aumento da atividade nervosa simpática via rRPa¹⁶. A ativação induzida pelo frio da MTD medida por termografia IR ou PET-CT é inadequada quando usada como uma medida para a atividade diária da MTD. O aumento da atividade da MTD após uma refeição é seguido pela utilização de glicose, o que é importante para manter a homeostase da glicose, a sensibilidade à insulina e a regulação diária da concentração de glicose. A ativação do MTD pós-prandial leva a um aumento no consumo de glicose pós-prandial, seguido por um aumento na produção de calor e na temperatura corporal (DIT). Isso se mostrou dependente de sexo, idade e IMC¹². Diferenças semelhantes entre os sexos na ativação das MTD após uma refeição são observadas em camundongos de laboratório machos e fêmeas¹⁷. Esses achados correspondem às diferenças de gênero recentemente descobertas na regulação da MTD por Burke e col., que mostraram que a regulação hipotalâmica do escurecimento da MTD via uma subpopulação de neurônios POMC difere em camundongos machos e fêmeas¹⁸. A ativação pós-prandial da MTD é menor em mulheres, populações mais velhas e obesos. A falta de ativação das MTD após uma refeição (diminuição da utilização de glicose) poderia levar a uma maior prevalência de intolerância à glicose em mulheres 19,20,21,22. Infelizmente, a maioria dos estudos sobre a ativação das MTD foi feita apenas em homens. Ao ativar a MTD após uma refeição, a captação de glicose aumenta na população masculina magra. Não é surpreendente que, após a ativação das MTD, a DIT seja maior em indivíduos do sexo masculino positivos para MTD ^8,9. Além disso, o transplante de MTD em camundongos machos melhora a tolerância à glicose, aumenta a sensibilidade à insulina e diminui o peso corporal e a massa gorda²³.

A PET-CT falha como método de escolha para medir a atividade das MTD, especialmente após uma refeição. Portanto, um método não invasivo e mais sensível foi desenvolvido. A termografia IR permite estimar a atividade da MTD em diferentes animais de laboratório (camundongos knock-out), bem como em participantes humanos, independentemente do sexo, idade ou dos efeitos de diferentes condições patológicas sobre a atividade da BAT. Um benefício adicional deste método é a simplicidade para os participantes e animais de laboratório, o que nos permite estimar os benefícios potenciais da terapia de reforço BAT. Os estudos recentes que utilizaram a termografia IR para determinar o comportamento fisiológico das MTD após exposição ao frio ou refeição estão descritos na recente publicação de Brasil et ^al.24.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais em animais de laboratório foram aprovados pelo Comitê Nacional de Ética e pelo Ministério da Agricultura (EP 185/2018). Os experimentos foram conduzidos de acordo com o Código de Ética da Sociedade Croata de Ciência Animal de Laboratório e as diretrizes do ARRIVE. Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo participantes humanos foram de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Zagreb (UP/…

Representative Results

A maneira mais fácil de determinar a atividade das MTD é subtrair a temperatura máxima da pele acima das MTD antes e depois de uma refeição em seres humanos. Uma melhor maneira de calcular a atividade da MTD é selecionar duas regiões de interesse: a área da pele acima da MTD, que está localizada na área supraclavicular, e a área interclavicular da pele onde não há tecido MTD em humanos, designada como área de referência (de acordo com a PET-CT; Gráfico 1). A atividade MTD é …

Discussion

Estudos recentes apresentam evidências crescentes sobre a regulação fisiológica e a importância da atividade das MTD em humanos e animais adultos no desenvolvimento da obesidade e diabetes mellitus. Além disso, a possível ativação de MTD por ativadores exógenos está se tornando um alvo para as empresas farmacêuticas. Para poder estimar a regulação fisiológica e a importância fisiopatológica das MTD em doenças muito onerosas, bem como descobrir uma potencial abordagem terapêutica, a termografia infraver…

Materials

0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020