Infrarød termografi til påvisning af ændringer i brun fedtvævsaktivitet

Summary

Her præsenterer vi en protokol til måling af brun fedtvævsaktivitet efter et måltid hos mennesker og forsøgsdyr.

Abstract

Måling af brunt fedtvæv (BAT) aktivitet ved positronemissionstomografi computertomografi (PET-CT) via akkumulering af ¹⁸F-fluorodeoxyglucose (FDG) efter et måltid eller hos overvægtige eller diabetespatienter mislykkes som den valgte metode. Hovedårsagen er, at ¹⁸F-FDG konkurrerer med den postprandielle høje glukoseplasmakoncentration for den samme glukosetransportør på membranen i BAT-celler. Derudover bruger BAT også fedtsyrer som energikilde, hvilket ikke er synligt med PET-CT og kan ændres sammen med glukosekoncentrationen hos overvægtige og diabetespatienter. For at estimere den fysiologiske betydning af BAT hos dyr og mennesker anvendes derfor en ny infrarød termografimetode, der anvendes i nyere publikationer.

Efter natlig faste blev BAT-aktivitet målt ved infrarød termografi før og efter et måltid hos frivillige forsøgspersoner og hunmus af vildtypen. Kamerasoftwaren beregner objektets temperatur ved hjælp af afstand fra objektet, hudens emissivitet, reflekteret stuetemperatur, lufttemperatur og relativ luftfugtighed. Hos mus var det barberede område over BAT et interesseområde, for hvilket gennemsnitlige og maksimale temperaturer blev målt. Fasen af østruscyklussen hos hunmus blev bestemt efter et eksperiment ved vaginale udstrygninger farvet med cresylviolet (0,1%) pletopløsning. Hos raske frivillige blev der valgt to hudområder i nakken: det supraklavikulære område (over kravebenet, hvor BAT-celler er til stede) og det interklavikulære område (mellem kravebenene, hvor der ikke er påvist BAT-væv). BAT-aktivitet bestemmes af subtraktionen af disse to værdier. De gennemsnitlige og maksimale temperaturer i hudområder kunne også bestemmes hos dyr og menneskelige deltagere.

Ændringer i BAT-aktivitet efter et måltid målt ved infrarød termografi, en ikke-invasiv og mere følsom metode, viste sig at være køn, alder og fase af brunstcyklussen afhængig hos forsøgsdyr. Som en del af diætinduceret termogenese viste BAT-aktivering hos mennesker sig også at være afhængig af køn, alder og kropsmasseindeks. Yderligere bestemmelse af de patofysiologiske ændringer i BAT-aktivitet efter et måltid vil være af stor betydning for deltagere med høje glukoseplasmakoncentrationer (fedme og diabetes mellitus type 2) såvel som hos forskellige forsøgsdyr (knock-out mus). Denne metode er også et variabelt værktøj til bestemmelse af mulige aktiverende lægemidler, der kan forynge BAT-aktivitet.

Introduction

Brunt fedtvæv (BAT), i modsætning til hvidt fedtvæv (WAT), lagrer ikke, men bruger snarere energi. Ved sympatisk stimulering udnytter BAT fedtsyrer og glukose og producerer varme ved aktivering af afkoblingsprotein 1 (UCP1). Funktionen af UCP1 er at bruge en H ⁺ gradient mellem to mitokondriemembraner til at producere varme i stedet for ATP. BAT’s funktion er at øge varmeproduktionen under kolde forhold, hvilket fører til en stigning i energiforbruget¹. Efter kold eksponering hæmmer sensoriske input fra huden varmefølsomme neuroner i den mediane præoptiske (MnPO) kerne i det hypothalamiske præoptiske område (POA), hvilket mindsker den hæmmende virkning af POA-neuroner på rostral raphe pallidus (rRPa). Aktiveringen af rRPa-neuroner øger sympatisk aktivitet, hvilket efterfølges af en stigning i BAT-aktivitet ^2,3. Koldinduceret BAT-aktivering forbedrer insulinfølsomheden hos mennesker⁴, og denne aktivitet er nedsat hos mennesker med øget body mass index (BMI) og alder 1,5,6,7.

Bortset fra dets rolle i koldinduceret termogenese øges glukoseoptagelsen i BAT efter et måltid i den magre mandlige population, hvilket bidrager til diætinduceret termogenese (DIT), som er højere hos BAT-positive mandlige forsøgspersoner ^8,9. Den avancerede teknik, der anvendes til måling af BAT-aktivitet, er positronemissionstomografi computertomografi, kendt som PET-CT. Denne metode bestemmer BAT-aktiviteten ved at måle akkumuleringen af fluorodeoxyglucose (¹⁸F-FDG). PET-CT fejler imidlertid som den foretrukne metode til påvisning af aktivering af BAT efter et måltid. En af grundene er, at ¹⁸F-FDG efter et måltid konkurrerer med postprandial hyperglykæmi om den samme glukosetransportør, hvilket gør den uegnet til bestemmelse af BAT-aktivering efter et måltid, især når man sammenligner BAT-aktivitet hos raske og diabetiske deltagere med mulige forskelle i blodglukosekoncentrationer. Desuden bruger BAT fedtsyrer som energikilde til varmeproduktion, hvilket ikke er synligt med PET-CT. ¹⁸ Ophobning af F-FDG i BAT efter et måltid er næsten ikke synlig¹⁰ og fortolkes derfor i de fleste tilfælde som et negativt resultat. Ikke overraskende blev det for nylig foreslået, at aktiveringen af BAT er mere udtalt i den menneskelige befolkning, end vi tidligere havde troet; derfor er der behov for en ny tilgang til påvisning af BAT-aktivitet og dens involvering i metaboliske lidelser⁷. Et forsøg på at løse dette problem er at måle volumen af BAT med magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) hos prædiabetiske patienter og patienter med diabetes mellitus type 2 (T2DM) med insulinresistens¹¹. BAT-volumen målt ved MR er imidlertid ikke en tilstrækkelig indikator til at estimere den daglige funktion og brug af glukose og fedtsyrer af BAT. For at estimere reelle forskelle i BAT-aktivitet hos raske versus T2DM-patienter er der derfor behov for en ny tilgang, der giver mulighed for at finde ud af den patologiske mekanisme for BAT-funktionsfejl hos T2DM-patienter.

For at bestemme aktiveringen af BAT udførte vi målinger af BAT-varmeproduktion før og efter et måltid ved hjælp af infrarød (IR) termografi (figur 1^)12,13. Etablering af IR-termografi som en metode til måling af BAT-aktivitet efter et måltid hos raske og overvægtige personer eller patienter med diabetes mellitus vil have en enorm indflydelse på feltet. Den dag i dag anvendes IR-termografi til bestemmelse af koldinduceret aktivering af BAT^13,14,15. I nyere menneskelig historie er kuldeinduceret BAT-aktivitet ikke særlig udtalt længere (på grund af korrekt opvarmning af levesteder, korrekt tøj), mens BAT-aktivering efter et måltid forekommer hver dag. Desuden er den fysiologiske regulering af disse to BAT-funktioner via hypothalamus helt forskellig. Efter et måltid fører aktiveringen af proopiomelanocortin (POMC)-ekspressive neuroner i den hypothalamiske bueformede kerne (Arc) til en stigning i sympatisk nerveaktivitet via rRPa¹⁶. Koldinduceret aktivering af BAT målt ved IR-termografi eller PET-CT er forkert, når det bruges som et mål for daglig BAT-aktivitet. Øget BAT-aktivitet efter et måltid efterfølges af glukoseudnyttelse, hvilket i sidste ende er vigtigt for at opretholde glukosehomeostase, insulinfølsomhed og den daglige regulering af glukosekoncentrationen. Postprandial BAT-aktivering fører til en stigning i postprandial glukoseforbrug efterfulgt af en stigning i varmeproduktion og kropstemperatur (DIT). Dette viste sig at være køn, alder og BMI-afhængig¹². Lignende kønsforskelle i BAT-aktivering efter et måltid observeres hos laboratoriemus til han- og hundyr¹⁷. Disse resultater svarer til nyligt opdagede kønsforskelle i reguleringen af BAT af Burke et al., der viste, at den hypothalamiske regulering af BAT browning via en underpopulation af POMC-neuroner adskiller sig hos han- og hunmus¹⁸. Den postprandielle aktivering af BAT er mindre hos kvinder, ældre befolkninger og overvægtige mennesker. Manglen på BAT-aktivering efter et måltid (nedsat glukoseudnyttelse) kan føre til en højere forekomst af nedsat glukosetolerance hos kvinder 19,20,21,22. Desværre blev størstedelen af undersøgelserne af BAT-aktivering kun udført på mænd. Ved at aktivere BAT efter et måltid øges glukoseoptagelsen i den magre mandlige population. Det er ikke overraskende, at DIT efter BAT-aktivering er højere hos BAT-positive mandlige forsøgspersoner ^8,9. Desuden forbedrer BAT-transplantation hos hanmus glukosetolerancen, øger insulinfølsomheden og nedsætter kropsvægt og fedtmasse²³.

PET-CT fejler som en valgfri metode til måling af BAT-aktivitet, især efter et måltid. Derfor blev der udviklet en ikke-invasiv og mere følsom metode. IR-termografi muliggør estimering af BAT-aktivitet i forskellige forsøgsdyr (knock-out-mus) såvel som menneskelige deltagere, uanset køn, alder eller virkningerne af forskellige patologiske tilstande på BAT-aktivitet. En yderligere fordel ved denne metode er enkelheden for deltagere og forsøgsdyr, som giver os mulighed for at estimere de potentielle fordele ved BAT-boosterterapi. De nylige undersøgelser, der bruger IR-termografi til bestemmelse af BAT’s fysiologiske adfærd efter kuldeeksponering eller et måltid, er beskrevet i den nylige publikation af Brasil et ^al.24.

Protocol

Alle forsøgsforsøg på forsøgsdyr blev godkendt af det nationale etiske udvalg og landbrugsministeriet (EP 185/2018). Forsøgene blev udført i overensstemmelse med det etiske kodeks fra The Croatian Society for Laboratory Animal Science og ARRIVE retningslinjer. Alle procedurer, der blev udført i undersøgelser, der involverede menneskelige deltagere, var i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen og godkendt af den etiske komité ved universitetet i Zagreb, School of Medicine (UP/I-322-01/18-01/56). I denne un…

Representative Results

Den nemmeste måde at bestemme BAT-aktivitet på er at trække den maksimale hudtemperatur over BAT før og efter et måltid hos mennesker. En bedre måde at beregne BAT-aktivitet på er at vælge to områder af interesse: hudområdet over BAT, som er placeret i det supraklavikulære område, og det interklavikulære område af huden, hvor der ikke findes BAT-væv hos mennesker, udpeget som referenceområde (ifølge PET-CT; Figur 1). BAT-aktivitet bestemmes derefter let ved subtraktion af di…

Discussion

Nylige undersøgelser viser voksende beviser for den fysiologiske regulering og betydningen af BAT-aktivitet hos voksne mennesker og dyr i udviklingen af fedme og diabetes mellitus. Desuden er mulig BAT-aktivering af eksogene aktivatorer ved at blive et mål for medicinalvirksomheder. For at kunne estimere den fysiologiske regulering og patofysiologiske betydning af BAT i meget byrdefulde sygdomme samt opdage en potentiel terapeutisk tilgang, bliver infrarød termografi den foretrukne metode. Selv om IR-teknologien er ve…

Materials

0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020