Kwantificering van circulaire RNA's met behulp van digitale druppel-PCR
Summary
Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methode van digitale druppel PCR (dd-PCR) voor nauwkeurige kwantificering van circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen met behulp van divergente primers.
Abstract
Digitale druppelpolymerasekettingreactie (dd-PCR) is een van de meest gevoelige kwantificeringsmethoden; het fractioneert de reactie in bijna 20.000 water-in-oliedruppels en de PCR komt voor in de individuele druppels. De dd-PCR heeft verschillende voordelen ten opzichte van conventionele real-time qPCR, waaronder verhoogde nauwkeurigheid bij het detecteren van doelen met een lage abundantie, het weglaten van referentiegenen voor kwantificering, het elimineren van technische replicaties voor monsters en het tonen van een hoge veerkracht tegen remmers in de monsters. Onlangs is dd-PCR een van de meest populaire methoden geworden voor het nauwkeurig kwantificeren van doel-DNA of RNA voor genexpressieanalyse en diagnostiek. Circulaire RNA’s (circRNA’s) zijn een grote familie van recent ontdekte covalent gesloten RNA-moleculen zonder 5′ en 3′ uiteinden. Het is aangetoond dat ze genexpressie reguleren door te fungeren als sponzen voor RNA-bindende eiwitten en microRNA’s. Bovendien worden circRNA’s uitgescheiden in lichaamsvloeistoffen en hun weerstand tegen exonucleasen zorgt ervoor dat ze dienen als biomarkers voor ziektediagnose. Dit artikel is bedoeld om te laten zien hoe divergent primerontwerp, RNA-extractie, cDNA-synthese en dd-PCR-analyse kunnen worden uitgevoerd om specifieke circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen nauwkeurig te kwantificeren. Tot slot demonstreren we de precieze kwantificering van circRNA’s met behulp van dd-PCR.
Introduction
Recente ontwikkelingen in RNA-sequencingtechnologieën en nieuwe computationele algoritmen hebben een nieuw lid ontdekt van de groeiende familie van niet-coderende RNA’s, genaamd circulair RNA (circRNA)1. Zoals de naam al doet vermoeden, zijn circRNA’s een familie van enkelstrengs RNA-moleculen zonder vrije uiteinden. Ze worden gevormd door niet-canonieke head-to-tail splicing genaamd back-splicing, waarbij de upstream splice acceptor site covalent aansluit op de downstream splice donor site om een stabiele RNA cirkel 1,2 te vormen. Dit proces kan worden gemedieerd door verschillende factoren, waaronder omgekeerde Alu-repetitieve elementen die aanwezig zijn in de upstream en downstream van gecirculeerde exonen, of kan worden gemedieerd door sommige splicingfactoren of RNA-bindende eiwitten (RBPs)2,3. Circulaire RNA’s die uitsluitend uit de exonische of intronische sequentie worden gegenereerd, worden geclassificeerd als exonische circRNA en circulaire intronische RNA’s of ci-RNA’s, terwijl sommige exonische circRNA’s het intron behouden en exon-intron circRNA’s (EIcircRNA’s) worden genoemd(EIcircRNA’s)3,4. De functies van circRNA’s zijn veelzijdig, waaronder het sponzen van miRNA en/of RBP, het reguleren van transcriptie en het reguleren van de cellulaire functie door te vertalen in peptiden 3,5,6,7. Verschillende rapporten hebben het belang van circRNA’s in verschillende ziekten en fysiologische processen benadrukt8. Bovendien maken weefselspecifieke expressiepatronen en resistentie tegen exonucleasevertering het een functionele biomarker voor ziektediagnose en kan het ook worden gebruikt als een geschikt therapeutisch doelwit8. Gezien het belang ervan bij het reguleren van gezondheid en ziekten, is de nauwkeurige kwantificering van circRNA-expressie de behoefte van het uur.
Er zijn verschillende biochemische methoden ontwikkeld om cirkelRNA’s in biologische monsters te kwantificeren9. Een van de handigste en meest geaccepteerde methoden voor circRNA-kwantificering is reverse transcriptie gevolgd door kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) met behulp van divergente primerparen10. De meerderheid van de circRNA’s is echter in lage abundantie in vergelijking met lineaire mRNA’s, waardoor het een uitdaging is om ze te kwantificeren11. Om dit probleem op te lossen, hebben we geprobeerd om digitale druppel-PCR (dd-PCR) te gebruiken om het aantal cirkel-RNA’s in een bepaald monster nauwkeurig te kwantificeren. De dd-PCR is een geavanceerde PCR-technologie die het microfluïdica-principe volgt; het genereert meerdere waterige druppels in olie en de PCR komt in elke druppel voor als een individuele reactie12. De reactie treedt op in individuele druppels en wordt geanalyseerd met behulp van een druppellezer, die het aantal positieve of negatieve druppels voor het gen van belang geeft12. Het is de meest gevoelige techniek om een gen van belang nauwkeurig te kwantificeren, zelfs als er slechts één kopie in een bepaald monster is. Verminderde gevoeligheid voor remmers, betere precisie en het weglaten van het referentiegen voor kwantificering maken het voordeliger dan conventionele qPCR 13,14,15. Het is op grote schaal gebruikt als een onderzoeks- en diagnostisch hulpmiddel voor de absolute kwantificering van een gen van belang16,17. Hier beschrijven we het gedetailleerde dd-PCR-protocol voor circRNA-kwantificering bij het differentiëren van muis C2C12-myotubes en prolifererende muis C2C12-myoblasten met behulp van divergente primers.
Protocol
Representative Results
Discussion
CircRNA-onderzoek is het afgelopen decennium gegroeid met de ontdekking van high-throughput sequencing-technologieën. Als gevolg hiervan is het beschouwd als een potentieel molecuul voor toekomstige RNA-therapeutica. Bovendien is bekend dat het fungeert als een biomarker bij verschillende ziekten, waaronder kanker en hart- en vaatziekten 4,8. De identificatie van circRNA is echter lastig vanwege de lage abundantie en het heeft slechts één specifieke backsplice…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door intramurale financiering van het Institute of Life Sciences, de DBT-onderzoeksbeurs (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) en de Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2/ 504017] toegekend aan Amaresh C. Panda. We bedanken andere lableden voor het proeflezen van het artikel.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
Riferimenti
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C., Xiao, J. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
