Quantification d’ARN circulaires par PCR numérique
Summary
Ce protocole décrit la méthode détaillée de PCR par gouttelettes numériques (dd-PCR) pour une quantification précise des niveaux d’ARN circulaire (circRNA) dans les cellules à l’aide d’amorces divergentes.
Abstract
La réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase (dd-PCR) est l’une des méthodes de quantification les plus sensibles; il fractionne la réaction en près de 20 000 gouttelettes d’eau dans l’huile, et la PCR se produit dans les gouttelettes individuelles. La dd-PCR présente plusieurs avantages par rapport à la qPCR conventionnelle en temps réel, notamment une précision accrue dans la détection des cibles de faible abondance, l’omission des gènes de référence pour la quantification, l’élimination des réplications techniques pour les échantillons et la démonstration d’une grande résilience aux inhibiteurs dans les échantillons. Récemment, la dd-PCR est devenue l’une des méthodes les plus populaires pour quantifier avec précision l’ADN ou l’ARN cible pour l’analyse de l’expression génique et le diagnostic. Les ARN circulaires (circRNA) sont une grande famille de molécules d’ARN fermées par covalence récemment découvertes dépourvues d’extrémités 5′ et 3′. Il a été démontré qu’ils régulent l’expression des gènes en agissant comme des éponges pour les protéines de liaison à l’ARN et les microARN. De plus, les circRNA sont sécrétés dans les fluides corporels et leur résistance aux exonucléases en fait des biomarqueurs pour le diagnostic des maladies. Cet article vise à montrer comment effectuer la conception d’amorces divergentes, l’extraction d’ARN, la synthèse de l’ADNc et l’analyse dd-PCR pour quantifier avec précision les niveaux spécifiques d’ARN circulaire (circRNA) dans les cellules. En conclusion, nous démontrons la quantification précise des circRNA à l’aide de la dd-PCR.
Introduction
Les progrès récents dans les technologies de séquençage de l’ARN et de nouveaux algorithmes de calcul ont permis de découvrir un nouveau membre de la famille croissante des ARN non codants, appelé ARN circulaire (circRNA)1. Comme leur nom l’indique, les circRNA sont une famille de molécules d’ARN simple brin sans extrémités libres. Ils sont formés par épissage tête à queue non canonique appelé épissage arrière, où le site accepteur d’épissage en amont se joint de manière covalente avec le site donneur d’épissage en aval pour former un cercle d’ARN stable 1,2. Ce processus pourrait être médié par plusieurs facteurs, y compris les éléments répétitifs Alu inversés présents en amont et en aval des exons circularisés, ou peut être médié par certains facteurs d’épissage ou protéines de liaison à l’ARN (RBP)2,3. Les ARN circulaires générés exclusivement à partir de la séquence exonique ou intronique sont classés comme circRNA exonique et ARN intronique circulaire ou ARN-ci, tandis que certains circRNA exoniques conservent l’intron et sont appelés circRNAs exon-intron (EIcircRNAs)3,4. Les fonctions des circRNA sont multiformes, y compris l’éponge des miARN et / ou RBP, la régulation de la transcription et la régulation de la fonction cellulaire en traduisant en peptides 3,5,6,7. Plusieurs rapports ont mis en évidence l’importance des circRNAs dans diverses maladies et processus physiologiques8. De plus, les schémas d’expression spécifiques aux tissus et la résistance à la digestion des exonucléases en font un biomarqueur fonctionnel pour le diagnostic de la maladie et il peut également être utilisé comme cible thérapeutique appropriée8. Compte tenu de son importance dans la régulation de la santé et des maladies, la quantification précise de l’expression de l’ARNcirc est le besoin de l’heure.
Plusieurs méthodes biochimiques ont été développées pour quantifier les circRNA dans des échantillons biologiques9. L’une des méthodes les plus pratiques et les plus largement acceptées pour la quantification de l’ARNcirc est la transcription inverse suivie d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR) utilisant des paires d’amorces divergentes10. Cependant, la majorité des circRNA sont en faible abondance par rapport aux ARNm linéaires, ce qui rend difficile leur quantification11. Pour surmonter ce problème, nous avons cherché à utiliser la PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) pour quantifier avec précision le nombre de circRNA dans un échantillon donné. La dd-PCR est une technologie de PCR avancée qui suit le principe de la microfluidique; il génère plusieurs gouttelettes aqueuses dans l’huile, et la PCR se produit dans chaque gouttelette comme une réaction individuelle12. La réaction se produit dans des gouttelettes individuelles et est analysée à l’aide d’un lecteur de gouttelettes, ce qui donne le nombre de gouttelettes positives ou négatives pour le gène d’intérêt12. C’est la technique la plus sensible pour quantifier avec précision un gène d’intérêt, même s’il n’y a qu’une seule copie dans un échantillon donné. La diminution de la sensibilité aux inhibiteurs, une meilleure précision et l’omission du gène de référence pour la quantification le rendent plus avantageux que la qPCRconventionnelle 13,14,15. Il a été largement utilisé comme outil de recherche et de diagnostic pour la quantification absolue d’un gène d’intérêt16,17. Ici, nous décrivons le protocole détaillé de dd-PCR pour la quantification circRNA dans la différenciation des myotubes C2C12 de souris et des myoblastes C2C12 de souris proliférants à l’aide d’amorces divergentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La recherche sur l’ARNcirc s’est développée au cours de la dernière décennie avec la découverte de technologies de séquençage à haut débit. En conséquence, il a été considéré comme une molécule potentielle pour les futurs traitements à ARN. En outre, il est connu pour agir comme biomarqueur dans plusieurs maladies, y compris le cancer et les maladies cardiovasculaires 4,8. Cependant, l’identification du circRNA est délicate en raison de sa …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par un financement intra-muros de l’Institut des sciences de la vie, la subvention de recherche DBT (BT/PR27622/MED/30/1961/2018) et la bourse Wellcome Trust/DBT India Alliance [IA/I/18/2/504017] attribuée à Amaresh C. Panda. Nous remercions les autres membres du laboratoire d’avoir relu l’article.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
Riferimenti
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