Kvantificering af cirkulære RNA'er ved hjælp af digital dråbe-PCR

Summary

Denne protokol beskriver den detaljerede metode til digital dråbe PCR (dd-PCR) til præcis kvantificering af cirkulære RNA (circRNA) niveauer i celler ved hjælp af divergerende primere.

Abstract

Digital dråbepolymerasekædereaktion (dd-PCR) er en af de mest følsomme kvantificeringsmetoder; det opdeler reaktionen i næsten 20.000 vand-i-olie-dråber, og PCR forekommer i de enkelte dråber. dd-PCR har flere fordele i forhold til konventionel qPCR i realtid, herunder øget nøjagtighed ved påvisning af mål med lav forekomst, udeladelse af referencegener til kvantificering, eliminering af tekniske replikater for prøver og viser høj modstandsdygtighed over for hæmmere i prøverne. For nylig er dd-PCR blevet en af de mest populære metoder til nøjagtig kvantificering af mål-DNA eller RNA til genekspressionsanalyse og diagnostik. Cirkulære RNA’er (circRNA’er) er en stor familie af nyligt opdagede kovalent lukkede RNA-molekyler, der mangler 5 ‘og 3’ ender. De har vist sig at regulere genekspression ved at fungere som svampe for RNA-bindende proteiner og mikroRNA’er. Desuden udskilles circRNA’er i kropsvæsker, og deres modstand mod exonukleaser får dem til at fungere som biomarkører til sygdomsdiagnose. Denne artikel har til formål at vise, hvordan man udfører divergerende primerdesign, RNA-ekstraktion, cDNA-syntese og dd-PCR-analyse for nøjagtigt at kvantificere specifikke cirkulære RNA (circRNA) niveauer i celler. Afslutningsvis demonstrerer vi den nøjagtige kvantificering af circRNA’er ved hjælp af dd-PCR.

Introduction

Nylige fremskridt inden for RNA-sekventeringsteknologier og nye beregningsalgoritmer har opdaget et nyt medlem af den voksende familie af ikke-kodende RNA’er, kaldet cirkulært RNA (circRNA)¹. Som navnet antyder, er circRNA’er en familie af enkeltstrengede RNA-molekyler uden frie ender. De er dannet ved ikke-kanonisk head-to-tail splejsning kaldet back-splejsning, hvor det opstrøms splejsningsacceptorsted forbinder kovalent med det nedstrøms splejsningsdonorsted for at danne en stabil RNA-cirkel ^1,2. Denne proces kan medieres af flere faktorer, herunder inverterede Alu gentagne elementer, der er til stede i opstrøms og nedstrøms for cirkulariserede exoner, eller kan medieres af nogle splejsningsfaktorer eller RNA-bindende proteiner (RBP’er)^2,3. Cirkulære RNA’er, der udelukkende genereres fra exonic eller intronic-sekvensen, klassificeres som exonic circRNA og cirkulære intronic RNA’er eller ci-RNA’er, mens nogle exonic circRNA’er bevarer intron og kaldes exon-intron circRNA’er (EIcircRNA’er)^3,4. Funktionerne i circRNA’er er mangefacetterede, herunder sponging miRNA og / eller RBP, regulering af transkription og regulering af cellulær funktion ved at oversætte til peptider 3,5,6,7. Flere rapporter har fremhævet betydningen af circRNA’er i forskellige sygdomme og fysiologiske processer⁸. Desuden gør vævsspecifikke ekspressionsmønstre og resistens over for exonukleasefordøjelse det til en funktionel biomarkør til sygdomsdiagnose, og det kan også bruges som et passende terapeutisk mål⁸. I betragtning af dets betydning for regulering af sundhed og sygdomme er den nøjagtige kvantificering af circRNA-ekspression timens behov.

Flere biokemiske metoder er blevet udviklet til kvantificering af circRNA’er i biologiske prøver⁹. En af de mest bekvemme og bredt accepterede metoder til circRNA-kvantificering er omvendt transkription efterfulgt af kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) ved anvendelse af divergerende primerpar¹⁰. Imidlertid er størstedelen af circRNA’er i lav overflod sammenlignet med lineære mRNA’er, hvilket gør det udfordrende at kvantificere dem¹¹. For at løse dette problem forsøgte vi at bruge digital dråbe-PCR (dd-PCR) til at kvantificere antallet af circRNA’er i en given prøve nøjagtigt. dd-PCR er en avanceret PCR-teknologi, der følger mikrofluidikprincippet; det genererer flere vandige dråber i olie, og PCR forekommer i hver dråbe som en individuel reaktion¹². Reaktionen forekommer i individuelle dråber og analyseres ved hjælp af en dråbelæser, som giver antallet af positive eller negative dråber for genet af interesse¹². Det er den mest følsomme teknik til nøjagtigt at kvantificere et gen af interesse, selvom der kun er en enkelt kopi i en given prøve. Nedsat følsomhed over for hæmmere, bedre præcision og udeladelse af referencegenet til kvantificering gør det mere fordelagtigt end konventionel qPCR^13,14,15. Det er blevet brugt i vid udstrækning som et forsknings- og diagnostisk værktøj til absolut kvantificering af et gen af interesse^16,17. Her beskriver vi den detaljerede dd-PCR-protokol til circRNA-kvantificering ved differentiering af mus C2C12 myorør og prolifererende mus C2C12 myoblaster ved hjælp af divergerende primere.

Protocol

RNA er følsomt over for RNaser; derfor bør alle reagenser, instrumenter og arbejdsområder være RNase-fri og håndteres med omhu. 1. Divergerende primerdesign til circRNA (se figur 1) Hent den modne sekvens fra circRNA-annotationsdata ved hjælp af BEDTools eller fra UCSC-genombrowseren ved at slutte sig til exon / intron-sekvensen, der er til stede mellem backsplice-forbindelseskoordinaterne18,19</s…

Representative Results

Det absolutte antal circRNA’er i hver prøve kan udledes af de eksporterede dd-PCR-data. Kvantitativ PCR-analyse i realtid foreslog differentiel ekspression af circBnc2 i de differentierede C2C12 myotuber (data ikke vist). Her ønskede vi at kontrollere det absolutte kopinummer af circBnc2 i prolifererende C2C12 myoblaster og myotubes. Da ekspressionen af circBnc2 sammenlignes under to betingelser, er det virkelig vigtigt at behandle alle prøver til RNA-isolering, cDNA-syntese og PCR samtidigt…

Discussion

CircRNA-forskning er vokset i det sidste årti med opdagelsen af high-throughput sekventeringsteknologier. Som et resultat er det blevet betragtet som et potentielt molekyle til fremtidige RNA-terapier. Derudover er det kendt for at fungere som en biomarkør i flere sygdomme, herunder kræft og hjerte-kar-sygdomme ^4,8. Imidlertid er identifikationen af circRNA vanskelig på grund af dens lave overflod, og den har kun en specifik backsplice-krydssekvens, der adski…

Materials

1.5 ml microcentifuge tube	Tarson	500010
0.2 ml tube strips with cap	Tarson	610020, 510073
Filter Tips	Tarson	528104
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977023
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Cell scrapper	HiMedia	TCP223
Chloroform	SRL	96764
DNA diluent	HiMedia	MB228
Random primers	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181
Murine RNase inhibitor	NEB	M0314S
Maxima reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix	Bio-Rad	1864033
Droplet generation oil for Evagreen	Bio-Rad	1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad	1864007
DG8 Cartridge holder	Bio-Rad	1863051
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Quantasoft Software	Bio-Rad	1864011
Silica column	Umbrella Life Science	38220090
UCSC Genome Browser		https://genome.ucsc.edu/
Primer 3		https://primer3.ut.ee/