Quantificazione di RNA circolari mediante Digital Droplet PCR
Summary
Questo protocollo descrive il metodo dettagliato della PCR digitale a goccia (dd-PCR) per una quantificazione precisa dei livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule utilizzando primer divergenti.
Abstract
La reazione a catena della polimerasi a goccia digitale (dd-PCR) è uno dei metodi di quantificazione più sensibili; fraziona la reazione in quasi 20.000 goccioline d’acqua in olio e la PCR si verifica nelle singole goccioline. La dd-PCR presenta diversi vantaggi rispetto alla qPCR convenzionale in tempo reale, tra cui una maggiore precisione nel rilevare bersagli a bassa abbondanza, omettendo geni di riferimento per la quantificazione, eliminando le repliche tecniche per i campioni e mostrando un’elevata resilienza agli inibitori nei campioni. Recentemente, la dd-PCR è diventata uno dei metodi più popolari per quantificare accuratamente il DNA o l’RNA bersaglio per l’analisi e la diagnostica dell’espressione genica. Gli RNA circolari (circRNA) sono una grande famiglia di molecole di RNA recentemente scoperte covalentemente chiuse prive di estremità 5′ e 3′. È stato dimostrato che regolano l’espressione genica agendo come spugne per le proteine leganti l’RNA e i microRNA. Inoltre, i circRNA sono secreti nei fluidi corporei e la loro resistenza alle esonucleasi li rende utili come biomarcatori per la diagnosi della malattia. Questo articolo ha lo scopo di mostrare come eseguire la progettazione di primer divergenti, l’estrazione dell’RNA, la sintesi del cDNA e l’analisi dd-PCR per quantificare accuratamente specifici livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule. In conclusione, dimostriamo la quantificazione precisa dei circRNA utilizzando dd-PCR.
Introduction
I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento dell’RNA e nuovi algoritmi computazionali hanno scoperto un nuovo membro della crescente famiglia di RNA non codificanti, chiamato RNA circolare (circRNA)1. Come suggerisce il nome, i circRNA sono una famiglia di molecole di RNA a singolo filamento senza estremità libere. Sono formati da splicing testa-coda non canonico chiamato back-splicing, in cui il sito accettore di giunzione a monte si unisce covalentemente con il sito donatore di giunzione a valle per formare un cerchio stabile di RNA 1,2. Questo processo potrebbe essere mediato da diversi fattori, tra cui elementi ripetitivi invertiti di Alu presenti a monte e a valle degli esoni circolarizzati o può essere mediato da alcuni fattori di splicing o proteine leganti l’RNA (RBP)2,3. Gli RNA circolari generati esclusivamente dalla sequenza esonica o intronica sono classificati come circRNA esonico e RNA intronici circolari o ci-RNA, mentre alcuni circRNA esonici trattengono l’introne e sono chiamati circRNA esone-introne (EIcircRNAs)3,4. Le funzioni dei circRNA sono molteplici, tra cui la spugnatura di miRNA e/o RBP, la regolazione della trascrizione e la regolazione della funzione cellulare traducendo in peptidi 3,5,6,7. Diversi rapporti hanno evidenziato il significato dei circRNA in varie malattie e processi fisiologici8. Inoltre, i modelli di espressione tessuto-specifici e la resistenza alla digestione esonucleasica lo rendono un biomarcatore funzionale per la diagnosi della malattia e può anche essere utilizzato come bersaglio terapeutico adatto8. Considerando la sua importanza nella regolazione della salute e delle malattie, la quantificazione accurata dell’espressione del circRNA è la necessità del momento.
Sono stati sviluppati diversi metodi biochimici per quantificare i circRNA in campioni biologici9. Uno dei metodi più convenienti e ampiamente accettati per la quantificazione del circRNA è la trascrizione inversa seguita dalla reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) utilizzando coppie di primer divergenti10. Tuttavia, la maggior parte dei circRNA sono in bassa abbondanza rispetto agli mRNA lineari, il che rende difficile quantificarli11. Per superare questo problema, abbiamo cercato di utilizzare la PCR digitale a goccia (dd-PCR) per quantificare accuratamente il numero di circRNA in un determinato campione. La dd-PCR è una tecnologia PCR avanzata che segue il principio della microfluidica; genera più goccioline acquose nell’olio e la PCR si verifica in ogni goccia come reazione individuale12. La reazione avviene nelle singole goccioline e viene analizzata utilizzando un lettore di goccioline, che fornisce il numero di goccioline positive o negative per il gene di interesse12. È la tecnica più sensibile per quantificare con precisione un gene di interesse, anche se c’è solo una singola copia in un dato campione. La diminuzione della sensibilità verso gli inibitori, la migliore precisione e l’omissione del gene di riferimento per la quantificazione lo rendono più vantaggioso rispetto alla qPCR convenzionale13,14,15. È stato ampiamente utilizzato come strumento di ricerca e diagnostica per la quantificazione assoluta di un gene di interesse16,17. Qui, descriviamo il protocollo dd-PCR dettagliato per la quantificazione del circRNA nella differenziazione dei miotubi C2C12 di topo e dei mioblasti C2C12 di topo proliferanti utilizzando primer divergenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricerca sul CircRNA è cresciuta nell’ultimo decennio con la scoperta di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento. Di conseguenza, è stata considerata una potenziale molecola per le future terapie a RNA. Inoltre, è noto per agire come biomarcatore in diverse malattie, tra cui il cancro e le malattie cardiovascolari 4,8. Tuttavia, l’identificazione del circRNA è difficile a causa della sua bassa abbondanza e ha solo una specifica sequenza di giunzione…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti intramurali dell’Institute of Life Sciences, dalla sovvenzione di ricerca DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) e dalla Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2 / 504017] assegnata ad Amaresh C. Panda. Ringraziamo gli altri membri del laboratorio per aver riletto l’articolo.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
Riferimenti
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