デジタル液滴PCRを用いた環状RNAの定量
Summary
このプロトコルでは、ダイバージェントプライマーを使用して細胞内の環状RNA(circRNA)レベルを正確に定量するためのデジタルドロップレットPCR(dd-PCR)の詳細な方法について説明します。
Abstract
デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(dd-PCR)は、最も感度の高い定量方法の1つです。反応を約20,000個の油中水滴に分画し、PCRは個々の液滴で行われます。dd-PCRは、低存在量のターゲットの検出精度の向上、定量のための参照遺伝子の省略、サンプルの技術的な複製の排除、サンプル中の阻害剤に対する高い回復力を示すなど、従来のリアルタイムqPCRに比べていくつかの利点があります。最近、dd-PCRは、遺伝子発現解析および診断のために標的DNAまたはRNAを正確に定量するための最も一般的な方法の1つになっています。環状RNA(circRNA)は、最近発見された共有結合的に閉じたRNA分子の大きなファミリーで、5’末端と3’末端を欠いています。それらは、RNA結合タンパク質およびマイクロRNAのスポンジとして作用することによって遺伝子発現を調節することが示されている。さらに、circRNAは体液中に分泌され、エキソヌクレアーゼに対する耐性があるため、疾患診断のバイオマーカーとして機能します。本稿では、ダイバージェントプライマー設計、RNA抽出、cDNA合成、およびdd-PCR分析を実行して、細胞内の特定の環状RNA(circRNA)レベルを正確に定量する方法を示すことを目的としています。結論として、dd-PCRを用いたcircRNAの正確な定量を実証する。
Introduction
RNAシーケンシング技術と新しい計算アルゴリズムの最近の進歩により、環状RNA(circRNA)1と呼ばれるノンコーディングRNAファミリーの新しいメンバーが発見されました。名前が示すように、circRNAは自由末端を持たない一本鎖RNA分子のファミリーです。これらは、バックスプライシングと呼ばれる非標準的なヘッドツーテールスプライシングによって形成され、上流のスプライスアクセプター部位が下流のスプライスドナー部位と共有結合して安定したRNAサークルを形成します1,2。このプロセスは、環状エクソンの上流および下流に存在する逆Alu反復要素を含むいくつかの要因によって媒介されるか、またはいくつかのスプライシング因子またはRNA結合タンパク質(RBP)によって媒介される可能性があります2,3。エキソン配列またはイントロニック配列のみから生成された環状RNAは、エキソンcircRNAおよび環状イントロニックRNAまたはci-RNAに分類されますが、一部のエキソンcircRNAはイントロンを保持し、エクソン-イントロンcircRNA(EIcircRNA)と呼ばれます3,4。circRNAの機能は、miRNAおよび/またはRBPのスポンジング、転写の調節、ペプチドへの翻訳による細胞機能の調節など、多面的です3,5,6,7。いくつかの報告は、さまざまな疾患や生理学的プロセスにおけるcircRNAの重要性を強調しています8。さらに、組織特異的な発現パターンとエキソヌクレアーゼ消化に対する耐性は、疾患診断のための機能的なバイオマーカーとなり、適切な治療標的としても使用することができます8。健康と病気の調節におけるその重要性を考えると、circRNA発現の正確な定量は時間の必要性です。
生物学的サンプル中のcircRNAを定量するために、いくつかの生化学的方法が開発されている9。circRNA定量のための最も便利で広く受け入れられている方法の1つは、逆転写とそれに続くダイバージェントプライマーペア10を使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)です。しかし、circRNAの大部分は直鎖状mRNAに比べて存在量が少ないため、定量することは困難です11。この問題を克服するために、デジタルドロップレットPCR(dd-PCR)を使用して、特定のサンプル中のcircRNAの数を正確に定量することを目指しました。dd-PCRは、マイクロフルイディクスの原理に従った高度なPCR技術です。油中に複数の水性液滴を生成し、個々の反応12として各液滴中でPCRが起こる。反応は個々の液滴で起こり、液滴リーダーを使用して分析され、目的の遺伝子に対する正または負の液滴の数が得られます12。これは、特定のサンプルにコピーが1つしかない場合でも、目的の遺伝子を正確に定量するための最も感度の高い手法です。阻害剤に対する感度の低下、精度の向上、定量のための参照遺伝子の省略により、従来のqPCR13,14,15よりも有利になります。これは、目的の遺伝子の絶対定量のための研究および診断ツールとして広く使用されています16,17。ここでは、ダイバージェントプライマーを用いたマウスC2C12筋細胞および増殖マウスC2C12筋芽細胞の分化におけるcircRNA定量のための詳細なdd-PCRプロトコルについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
CircRNAの研究は、ハイスループットシーケンシング技術の発見により、過去10年間で成長しました。その結果、将来のRNA治療薬の潜在的な分子と見なされています。さらに、癌や心血管疾患を含むいくつかの疾患においてバイオマーカーとして作用することが知られている4,8。しかしながら、circRNAの同定は、その存在量が少なく、親mRNA…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、生命科学研究所からの壁内資金、DBT研究助成金(BT / PR27622 / MED/30/1961/2018)、およびウェルカムトラスト/ DBTインドアライアンスフェローシップ[IA / I / 18/2/504017]によってサポートされましたアマレシュC.パンダに授与されました。論文を校正してくださった他の研究室メンバーに感謝します。
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
Riferimenti
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