Kvantifisering av sirkulære RNA ved bruk av Digital Droplet PCR

Summary

Denne protokollen beskriver den detaljerte metoden for digital dråpe-PCR (dd-PCR) for presis kvantifisering av sirkulære RNA (circRNA) nivåer i celler ved hjelp av divergerende primere.

Abstract

Digital dråpepolymerasekjedereaksjon (dd-PCR) er en av de mest følsomme kvantifiseringsmetodene; det fraksjonerer reaksjonen i nesten 20.000 vann-i-olje-dråper, og PCR forekommer i de enkelte dråpene. DD-PCR har flere fordeler i forhold til konvensjonell sanntids qPCR, inkludert økt nøyaktighet i å oppdage mål med lav overflod, utelate referansegener for kvantifisering, eliminere tekniske replikasjoner for prøver og vise høy motstandskraft mot hemmere i prøvene. Nylig har dd-PCR blitt en av de mest populære metodene for nøyaktig kvantifisering av mål-DNA eller RNA for genuttrykksanalyse og diagnostikk. Sirkulære RNA (circRNA) er en stor familie av nylig oppdagede kovalent lukkede RNA-molekyler som mangler 5 ‘og 3’ ender. De har vist seg å regulere genuttrykk ved å fungere som svamper for RNA-bindende proteiner og mikroRNA. Videre utskilles circRNA i kroppsvæsker, og deres motstand mot eksonukleaser gjør at de tjener som biomarkører for sykdomsdiagnose. Denne artikkelen tar sikte på å vise hvordan man utfører divergerende primerdesign, RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese og dd-PCR-analyse for å nøyaktig kvantifisere spesifikke sirkulære RNA (circRNA) nivåer i celler. Avslutningsvis demonstrerer vi den nøyaktige kvantifiseringen av circRNA ved bruk av dd-PCR.

Introduction

Nylige fremskritt innen RNA-sekvenseringsteknologier og nye beregningsalgoritmer har oppdaget et nytt medlem av den voksende familien av ikke-kodende RNAer, kalt sirkulær RNA (circRNA)¹. Som navnet antyder, er circRNA en familie av enkeltstrengede RNA-molekyler uten frie ender. De dannes av ikke-kanonisk spleising fra hode til hale kalt back-splicing, hvor oppstrøms spleiseakseptorstedet går sammen med nedstrøms spleisedonorstedet for å danne en stabil RNA-sirkel ^1,2. Denne prosessen kan være mediert av flere faktorer, inkludert inverterte Alu-repeterende elementer som er tilstede i oppstrøms og nedstrøms sirkulæriserte eksoner, eller kan medieres av noen spleisingsfaktorer eller RNA-bindende proteiner (RBP) ^2,3. Sirkulære RNA generert utelukkende fra den eksoniske eller introniske sekvensen klassifiseres som eksoniske circRNA og sirkulære introniske RNA eller ci-RNA, mens noen eksoniske circRNAer beholder intronet og kalles ekson-intron circRNA (EIcircRNAs)^3,4. Funksjonene til circRNA er mangefasetterte, inkludert sponging miRNA og / eller RBP, regulering av transkripsjon og regulering av cellulær funksjon ved å oversette til peptider 3,5,6,7. Flere rapporter har fremhevet betydningen av circRNA i ulike sykdommer og fysiologiske prosesser⁸. Videre gjør vevsspesifikke uttrykksmønstre og motstand mot eksonukleasefordøyelse det til en funksjonell biomarkør for sykdomsdiagnose, og den kan også brukes som et egnet terapeutisk mål⁸. Med tanke på dens betydning for å regulere helse og sykdommer, er den nøyaktige kvantifiseringen av circRNA-uttrykk behovet for timen.

Det er utviklet flere biokjemiske metoder for å kvantifisere circRNA i biologiske prøver⁹. En av de mest praktiske og allment aksepterte metodene for circRNA-kvantifisering er revers transkripsjon etterfulgt av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) ved bruk av divergerende primerpar¹⁰. Imidlertid er flertallet av circRNA i lav overflod sammenlignet med lineære mRNA, noe som gjør det utfordrende å kvantifisere dem¹¹. For å løse dette problemet søkte vi å bruke digital dråpe-PCR (dd-PCR) for å kvantifisere antall circRNA i en gitt prøve nøyaktig. DD-PCR er en avansert PCR-teknologi som følger mikrofluidikkprinsippet; det genererer flere vandige dråper i olje, og PCR forekommer i hver dråpe som en individuell reaksjon¹². Reaksjonen skjer i individuelle dråper og analyseres ved hjelp av en dråpeleser, som gir antall positive eller negative dråper for genet av interesse¹². Det er den mest følsomme teknikken for å nøyaktig kvantifisere et gen av interesse, selv om det bare er en enkelt kopi i en gitt prøve. Redusert følsomhet overfor inhibitorer, bedre presisjon og utelatelse av referansegenet for kvantifisering gjør det mer fordelaktig enn konvensjonell qPCR^13,14,15. Det har blitt mye brukt som et forsknings- og diagnostisk verktøy for absolutt kvantifisering av et gen av interesse^16,17. Her beskriver vi den detaljerte dd-PCR-protokollen for circRNA-kvantifisering ved differensiering av mus C2C12 myotuber og prolifererende mus C2C12 myoblaster ved bruk av divergerende primere.

Protocol

RNA er følsomt for RNases; Derfor bør alle reagenser, instrumenter og arbeidsområder være RNase-frie og håndteres med forsiktighet. 1. Divergerende primerdesign for circRNA (se figur 1) Hent den modne sekvensen fra circRNA-merknadsdata ved hjelp av BEDTools eller fra UCSC-genomleseren ved å bli med i ekson / intronsekvensen som er tilstede mellom backsplice-krysskoordinatene18,19<…

Representative Results

Det absolutte antallet circRNA i hver prøve kan utledes fra de eksporterte dd-PCR-dataene. Real-time kvantitativ PCR-analyse foreslo differensialuttrykk av circBnc2 i de differensierte C2C12-myorørene (data ikke vist). Her ønsket vi å sjekke det absolutte kopinummeret til circBnc2 i prolifererende C2C12 myoblaster og myorør. Siden uttrykket av circBnc2 sammenlignes i to forhold, er det veldig viktig å behandle alle prøver for RNA-isolasjon, cDNA-syntese og PCR samtidig ved bruk av samme …

Discussion

CircRNA-forskning har vokst det siste tiåret med oppdagelsen av sekvenseringsteknologier med høy gjennomstrømning. Som et resultat har det blitt ansett som et potensielt molekyl for fremtidige RNA-terapier. I tillegg er det kjent å fungere som en biomarkør ved flere sykdommer, inkludert kreft og hjerte- og karsykdommer ^4,8. Imidlertid er identifiseringen av circRNA vanskelig på grunn av sin lave overflod, og den har bare en spesifikk tilbakeslagskrysssekven…

Materials

1.5 ml microcentifuge tube	Tarson	500010
0.2 ml tube strips with cap	Tarson	610020, 510073
Filter Tips	Tarson	528104
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977023
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Cell scrapper	HiMedia	TCP223
Chloroform	SRL	96764
DNA diluent	HiMedia	MB228
Random primers	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181
Murine RNase inhibitor	NEB	M0314S
Maxima reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix	Bio-Rad	1864033
Droplet generation oil for Evagreen	Bio-Rad	1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad	1864007
DG8 Cartridge holder	Bio-Rad	1863051
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Quantasoft Software	Bio-Rad	1864011
Silica column	Umbrella Life Science	38220090
UCSC Genome Browser		https://genome.ucsc.edu/
Primer 3		https://primer3.ut.ee/