Quantificação de RNAs circulares usando PCR de gotículas digitais
Summary
Este protocolo descreve o método detalhado de PCR de gotículas digitais (dd-PCR) para quantificação precisa dos níveis de RNA circular (circRNA) em células usando primers divergentes.
Abstract
A reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais (dd-PCR) é um dos métodos de quantificação mais sensíveis; ele fraciona a reação em quase 20.000 gotículas de água em óleo, e a PCR ocorre nas gotículas individuais. A dd-PCR tem várias vantagens sobre a qPCR convencional em tempo real, incluindo maior precisão na detecção de alvos de baixa abundância, omitindo genes de referência para quantificação, eliminando replicações técnicas para amostras e mostrando alta resiliência a inibidores nas amostras. Recentemente, o dd-PCR tornou-se um dos métodos mais populares para quantificar com precisão o DNA ou RNA alvo para análise e diagnóstico da expressão gênica. RNAs circulares (circRNAs) são uma grande família de moléculas de RNA covalentemente fechadas recentemente descobertas sem extremidades de 5′ e 3′. Eles demonstraram regular a expressão gênica agindo como esponjas para proteínas de ligação ao RNA e microRNAs. Além disso, os circRNAs são secretados em fluidos corporais, e sua resistência às exonucleases faz com que eles sirvam como biomarcadores para o diagnóstico de doenças. Este artigo tem como objetivo mostrar como realizar o desenho de primer divergente, extração de RNA, síntese de cDNA e análise de dd-PCR para quantificar com precisão os níveis específicos de RNA circular (circRNA) nas células. Em conclusão, demonstramos a quantificação precisa de circRNAs usando dd-PCR.
Introduction
Avanços recentes em tecnologias de sequenciamento de RNA e novos algoritmos computacionais descobriram um novo membro da crescente família de RNAs não codificantes, chamado RNA circular (circRNA)1. Como o nome sugere, os circRNAs são uma família de moléculas de RNA de fita simples sem extremidades livres. Eles são formados por splicing não-canônico da cabeça à cauda chamado back-splicing, onde o local aceptor da emenda a montante se une covalentemente com o local doador da emenda a jusante para formar um círculo estável de RNA 1,2. Esse processo pode ser mediado por diversos fatores, incluindo elementos repetitivos de Alu invertidos presentes no montante e a jusante de éxons circularizados, ou pode ser mediado por alguns fatores de splicing ou proteínas de ligação de RNA (RBPs)2,3. Os RNAs circulares gerados exclusivamente a partir da sequência exônica ou intrônica são classificados como circRNA exônico e RNAs intrônicos circulares ou ci-RNAs, enquanto alguns circRNAs exônicos retêm o íntron e são chamados de circRNAs de íntron éxon (EIcircRNAs)3,4. As funções dos circRNAs são multifacetadas, incluindo a esponja de miRNA e/ou RBP, regulando a transcrição e regulando a função celular por meio da tradução em peptídeos 3,5,6,7. Vários relatos têm destacado a importância dos circRNAs em diversas doenças e processos fisiológicos8. Além disso, os padrões de expressão tecidual específicos e a resistência à digestão da exonuclease a tornam um biomarcador funcional para o diagnóstico da doença e também podem ser utilizados como alvo terapêutico adequado8. Considerando sua importância na regulação da saúde e das doenças, a quantificação precisa da expressão do circRNA é a necessidade da hora.
Vários métodos bioquímicos têm sido desenvolvidos para quantificar circRNAs em amostras biológicas9. Um dos métodos mais convenientes e amplamente aceitos para a quantificação do circRNA é a transcrição reversa, seguida pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (RT-qPCR) usando pares de iniciadores divergentes10. No entanto, a maioria dos circRNAs está em baixa abundância em comparação com os mRNAs lineares, o que torna difícil quantificá-los11. Para superar esse problema, buscou-se utilizar a PCR de gotículas digitais (dd-PCR) para quantificar com precisão o número de circRNAs em uma determinada amostra. O dd-PCR é uma tecnologia avançada de PCR que segue o princípio da microfluídica; gera múltiplas gotículas aquosas no óleo, e a PCR ocorre em cada gota como uma reação individual12. A reação ocorre em gotículas individuais e é analisada por meio de um leitor de gotículas, que fornece o número de gotículas positivas ou negativas para o gene de interesse12. É a técnica mais sensível para quantificar com precisão um gene de interesse, mesmo que haja apenas uma única cópia em uma determinada amostra. A diminuição da sensibilidade aos inibidores, a melhor precisão e a omissão do gene de referência para quantificação o tornam mais vantajoso do que a qPCR convencional13,14,15. Tem sido amplamente utilizado como ferramenta de pesquisa e diagnóstico para a quantificação absoluta de um gene de interesse16,17. Aqui, descrevemos o protocolo detalhado de dd-PCR para quantificação de circRNA na diferenciação de miotubos C2C12 de camundongos e mioblastos C2C12 de camundongos proliferantes usando primers divergentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesquisa de circRNA cresceu na última década com a descoberta de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento. Como resultado, tem sido considerada uma molécula potencial para futuras terapias de RNA. Além disso, sabe-se que atua como biomarcador em diversas doenças, incluindo câncer e doenças cardiovasculares 4,8. No entanto, a identificação do circRNA é complicada devido à sua baixa abundância e possui apenas uma sequência específica de jun?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por financiamento intramural do Instituto de Ciências da Vida, a bolsa de pesquisa DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) e a Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017] concedida a Amaresh C. Panda. Agradecemos a outros membros do laboratório pela revisão do artigo.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
Riferimenti
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