Kvantifiering av cirkulära RNA med hjälp av digital dropp-PCR

Summary

Detta protokoll beskriver den detaljerade metoden för digital dropp-PCR (dd-PCR) för exakt kvantifiering av cirkulära RNA -nivåer (circRNA) i celler med hjälp av divergerande primers.

Abstract

Digital dropppolymeraskedjereaktion (dd-PCR) är en av de mest känsliga kvantifieringsmetoderna; det fraktionerar reaktionen i nästan 20 000 vatten-i-oljedroppar, och PCR förekommer i de enskilda dropparna. dd-PCR har flera fördelar jämfört med konventionell qPCR i realtid, inklusive ökad noggrannhet vid detektering av mål med låg förekomst, utelämnande av referensgener för kvantifiering, eliminering av tekniska replikat för prover och visning av hög motståndskraft mot hämmare i proverna. Nyligen har dd-PCR blivit en av de mest populära metoderna för att exakt kvantifiera mål-DNA eller RNA för genuttrycksanalys och diagnostik. Cirkulära RNA (circRNA) är en stor familj av nyligen upptäckta kovalent slutna RNA-molekyler som saknar 5 ‘och 3’ ändar. De har visat sig reglera genuttryck genom att fungera som svampar för RNA-bindande proteiner och mikroRNA. Dessutom utsöndras circRNA i kroppsvätskor, och deras motståndskraft mot exonukleas gör att de fungerar som biomarkörer för sjukdomsdiagnos. Denna artikel syftar till att visa hur man utför divergerande primerdesign, RNA-extraktion, cDNA-syntes och dd-PCR-analys för att exakt kvantifiera specifika cirkulära RNA (circRNA) nivåer i celler. Sammanfattningsvis demonstrerar vi den exakta kvantifieringen av circRNA med hjälp av dd-PCR.

Introduction

De senaste framstegen inom RNA-sekvenseringsteknik och nya beräkningsalgoritmer har upptäckt en ny medlem av den växande familjen av icke-kodande RNA, kallat cirkulärt RNA (circRNA)¹. Som namnet antyder är circRNA en familj av enkelsträngade RNA-molekyler utan fria ändar. De bildas av icke-kanonisk head-to-tail-skarvning som kallas back-skarvning, där uppströms skarvacceptorplatsen förenas kovalent med nedströms skarvdonatorstället för att bilda en stabil RNA-cirkel ^1,2. Denna process kan förmedlas av flera faktorer, inklusive inverterade Alu-repetitiva element som finns i uppströms och nedströms cirkulära exoner, eller kan förmedlas av vissa skarvningsfaktorer eller RNA-bindande proteiner (RBP)^2,3. Cirkulära RNA som genereras uteslutande från den exoniska eller introniska sekvensen klassificeras som exoniskt circRNA och cirkulära introniska RNA eller ci-RNA, medan vissa exoniska circRNA behåller intron och kallas exon-intron circRNA (EIcircRNA)^3,4. CircRNA: s funktioner är mångfacetterade, inklusive sponging miRNA och / eller RBP, reglering av transkription och reglering av cellulär funktion genom att översätta till peptider 3,5,6,7. Flera rapporter har belyst betydelsen av circRNA i olika sjukdomar och fysiologiska processer⁸. Dessutom gör vävnadsspecifika uttrycksmönster och resistens mot exonukleassmältning det till en funktionell biomarkör för sjukdomsdiagnos och det kan också användas som ett lämpligt terapeutiskt mål⁸. Med tanke på dess betydelse för att reglera hälsa och sjukdomar är den exakta kvantifieringen av circRNA-uttryck behovet av timmen.

Flera biokemiska metoder har utvecklats för att kvantifiera circRNA i biologiska prover⁹. En av de mest praktiska och allmänt accepterade metoderna för circRNA-kvantifiering är omvänd transkription följt av kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) med användning av divergerande primerpar¹⁰. Majoriteten av circRNA är dock i låg överflöd jämfört med linjära mRNA, vilket gör det utmanande att kvantifiera dem¹¹. För att lösa detta problem försökte vi använda digital dropp-PCR (dd-PCR) för att kvantifiera antalet circRNA i ett givet prov exakt. dd-PCR är en avancerad PCR-teknik som följer mikrofluidikprincipen; det genererar flera vattenhaltiga droppar i olja, och PCR förekommer i varje droppe som en individuell reaktion¹². Reaktionen sker i enskilda droppar och analyseras med hjälp av en droppläsare, vilket ger antalet positiva eller negativa droppar för genen av intresse¹². Det är den mest känsliga tekniken för att exakt kvantifiera en gen av intresse, även om det bara finns en enda kopia i ett givet prov. Minskad känslighet för hämmare, bättre precision och utelämnande av referensgenen för kvantifiering gör den mer fördelaktig än konventionell qPCR^13,14,15. Det har använts i stor utsträckning som ett forsknings- och diagnostiskt verktyg för absolut kvantifiering av en gen av intresse^16,17. Här beskriver vi det detaljerade dd-PCR-protokollet för circRNA-kvantifiering vid differentiering av mus C2C12-myorör och prolifererande mus C2C12-myoblaster med hjälp av divergerande primers.

Protocol

RNA är känsligt för RNaser; Därför bör alla reagenser, instrument och arbetsytor vara RNase-fria och hanteras med försiktighet. 1. Avvikande primerdesign för circRNA (se figur 1) Hämta den mogna sekvensen från circRNA-annoteringsdata med BEDTools eller från UCSC-genomwebbläsaren genom att gå med i exon / intron-sekvensen som finns mellan backsplice-korsningskoordinaterna18,19</su…

Representative Results

Det absoluta antalet circRNA i varje prov kan härledas från exporterade dd-PCR-data. Kvantitativ PCR-analys i realtid föreslog differentiellt uttryck av circBnc2 i de differentierade C2C12-myorören (data visas inte). Här ville vi kontrollera det absoluta kopieringsnumret för circBnc2 i prolifererande C2C12-myoblaster och myotubes. Eftersom uttrycket av circBnc2 jämförs under två förhållanden är det verkligen viktigt att bearbeta alla prover för RNA-isolering, cDNA-syntes och PCR sa…

Discussion

CircRNA-forskningen har vuxit under det senaste decenniet med upptäckten av sekvenseringsteknik med hög genomströmning. Som ett resultat har det ansetts vara en potentiell molekyl för framtida RNA-terapier. Dessutom är det känt att fungera som en biomarkör vid flera sjukdomar, inklusive cancer och hjärt-kärlsjukdomar ^4,8. Identifieringen av circRNA är dock knepig på grund av dess låga överflöd och den har bara en specifik backsplice-korsningssekvens…

Materials

1.5 ml microcentifuge tube	Tarson	500010
0.2 ml tube strips with cap	Tarson	610020, 510073
Filter Tips	Tarson	528104
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977023
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Cell scrapper	HiMedia	TCP223
Chloroform	SRL	96764
DNA diluent	HiMedia	MB228
Random primers	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181
Murine RNase inhibitor	NEB	M0314S
Maxima reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix	Bio-Rad	1864033
Droplet generation oil for Evagreen	Bio-Rad	1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad	1864007
DG8 Cartridge holder	Bio-Rad	1863051
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Quantasoft Software	Bio-Rad	1864011
Silica column	Umbrella Life Science	38220090
UCSC Genome Browser		https://genome.ucsc.edu/
Primer 3		https://primer3.ut.ee/