Un triplo modello di coltura cellulare primaria della barriera emato-encefalica umana per lo studio dell'ictus ischemico in vitro
Summary
Qui, descriviamo il metodo per stabilire un modello di coltura cellulare tripla della barriera emato-encefalica basato su cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello umano, astrociti e periciti. Questo modello multicellulare è adatto per studi di disfunzione delle unità neurovascolari durante l’ictus ischemico in vitro o per lo screening di farmaci candidati.
Abstract
L’ictus ischemico è una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo con opzioni terapeutiche limitate. La neuropatologia dell’ictus ischemico è caratterizzata da un’interruzione dell’afflusso di sangue al cervello che porta alla morte cellulare e alla disfunzione cognitiva. Durante e dopo l’ictus ischemico, la disfunzione della barriera emato-encefalica (BBB) facilita la progressione della lesione e contribuisce a uno scarso recupero del paziente. Gli attuali modelli di BBB includono principalmente monocolture endoteliali e doppie co-colture con astrociti o periciti.
Tali modelli non hanno la capacità di imitare completamente un microambiente cerebrale dinamico, che è essenziale per la comunicazione cellula-cellula. Inoltre, i modelli BBB comunemente usati contengono spesso cellule endoteliali umane immortalizzate o colture cellulari di derivazione animale (roditori, suini o bovini) che pongono limitazioni traslazionali. Questo articolo descrive un nuovo modello di BBB basato su inserti contenenti solo cellule umane primarie (cellule endoteliali microvascolari cerebrali, astrociti e periciti vascolari cerebrali) che consente lo studio del danno cerebrale ischemico in vitro.
Gli effetti della deprivazione di ossigeno-glucosio (OGD) sull’integrità della barriera sono stati valutati mediante misurazioni di permeabilità passiva, resistenza elettrica transendoteliale (TEER) e visualizzazione diretta delle cellule ipossiche. Il protocollo presentato offre un netto vantaggio nell’imitare l’ambiente intercellulare della BBB in vivo, fungendo da modello di BBB in vitro più realistico per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche nel contesto della lesione cerebrale ischemica.
Introduction
L’ictus è una delle principali cause di morte e disabilità a lungo termine in tutto il mondo1. L’incidenza dell’ictus aumenta rapidamente con l’età, raddoppiando ogni 10 anni dopo i 55 anni2. L’ictus ischemico si verifica a seguito di un’interruzione del flusso sanguigno cerebrale dovuta a eventi trombotici ed embolici, che comprende oltre l’80% di tutti i casi di ictus3. Anche ora, ci sono relativamente poche opzioni di trattamento disponibili per ridurre al minimo la morte dei tessuti dopo l’ictus ischemico. I trattamenti esistenti sono sensibili al tempo e di conseguenza non sempre portano a buoni risultati clinici. Pertanto, è urgentemente necessaria la ricerca sui complessi meccanismi cellulari dell’ictus ischemico che influenzano il recupero post-ictus.
La BBB è un’interfaccia dinamica per lo scambio di molecole tra il sangue e il parenchima cerebrale. Strutturalmente, la BBB è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali interconnesse da complessi giunzionali circondati da una membrana basale, periciti e estremità astrocitiche4. Periti e astrociti svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento dell’integrità della BEE attraverso la secrezione di vari fattori necessari per la formazione di giunzioni forti e strette 5,6. La rottura della BBB è uno dei tratti distintivi dell’ictus ischemico. La risposta infiammatoria acuta e lo stress ossidativo associati all’ischemia cerebrale provocano la rottura dei complessi proteici a giunzione stretta e la diafonia disregolata tra astrociti, periciti e cellule endoteliali, che porta ad un aumento della permeabilità del soluto paracellulare attraverso la BBB7. La disfunzione della BEE promuove ulteriormente la formazione di edema cerebrale e aumenta il rischio di trasformazione emorragica8. Considerando tutto quanto sopra, c’è un grande interesse nella comprensione dei cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano a livello di BBB durante e dopo l’ictus ischemico.
Sebbene molti modelli di BBB in vitro siano stati sviluppati negli ultimi decenni e utilizzati in una varietà di studi, nessuno di essi può replicare completamente le condizioni in vivo 9. Mentre alcuni modelli sono basati su monostrati di cellule endoteliali coltivati su supporti permeabili ben inseriti da soli o in combinazione con periciti o astrociti, solo studi più recenti hanno introdotto progetti di modelli di coltura cellulare tripla. Quasi tutti i modelli esistenti di tripla coltura BBB incorporano cellule endoteliali cerebrali primarie insieme ad astrociti e periciti isolati da specie animali o cellule derivate da cellule staminali pluripotenti umane10,11,12,13.
Riconoscendo la necessità di ricapitolare meglio la BBB umana in vitro, abbiamo stabilito un modello di BBB in vitro con tripla coltura cellulare composto da cellule endoteliali microvascolari del cervello umano (HBMEC), astrociti umani primari (HA) e periciti vascolari primari del cervello umano (HBVP). Questo modello BBB a tripla coltura è impostato su inserti in membrana di poliestere a 6 pozzetti con dimensioni dei pori di 0,4 μm. Questi inserti forniscono un ambiente ottimale per l’attacco cellulare e consentono un facile accesso ai compartimenti apicali (sangue) e basolaterale (cervello) per il campionamento medio o l’applicazione di composti. Le caratteristiche di questo modello di BBB di coltura a tripla cellula proposto sono valutate misurando TEER e flusso paracellulare post OGD che imita l’ictus ischemico in vitro, con una carenza di ossigeno (<1% O2) e nutrienti (utilizzando terreno privo di glucosio) ottenuta utilizzando una camera umidificata e sigillata. Inoltre, le condizioni ischemiche-simili indotte in questo modello sono accuratamente verificate mediante visualizzazione diretta delle cellule ipossiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, descriviamo un metodo per impostare un modello affidabile di coltura di cellule tripli endoteliali-periciti-astrociti per lo studio della disfunzione della BEE nel contesto dell’ictus ischemico in vitro. Considerando che i periciti sono i vicini più prossimi delle cellule endoteliali in vivo, gli HBVP sono placcati sul lato inferiore degli inserti del pozzo in questo modello16. Sebbene questa configurazione manchi della comunicazione diretta cellula-cellula…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA040537, DA039576, DA040537, DA050528 e DA047157.
Materials
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
Riferimenti
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