Um Modelo de Cultura de Células Primárias Triplas da Barreira Hematoencefálica Humana para o Estudo do Acidente Vascular Cerebral Isquêmico In Vitro

Summary

Aqui, descrevemos o método para estabelecer um modelo de cultura de células triplas da barreira hematoencefálica baseado em células endoteliais microvasculares cerebrais humanas primárias, astrócitos e pericitos. Este modelo multicelular é adequado para estudos de disfunção da unidade neurovascular durante acidente vascular cerebral isquêmico in vitro ou para a triagem de candidatos a medicamentos.

Abstract

O acidente vascular cerebral isquêmico é uma das principais causas de morte e incapacidade em todo o mundo, com opções terapêuticas limitadas. A neuropatologia do acidente vascular cerebral isquêmico é caracterizada por uma interrupção no suprimento de sangue para o cérebro, levando à morte celular e disfunção cognitiva. Durante e após o acidente vascular cerebral isquêmico, a disfunção da barreira hematoencefálica (BBB) facilita a progressão da lesão e contribui para a má recuperação do paciente. Os modelos atuais de BBB incluem principalmente monoculturas endoteliais e coculturas duplas com astrócitos ou pericitos.

Tais modelos não têm a capacidade de imitar completamente um microambiente cerebral dinâmico, o que é essencial para a comunicação célula-a-célula. Além disso, os modelos BBB comumente usados geralmente contêm células endoteliais humanas imortalizadas ou culturas de células derivadas de animais (roedores, suínos ou bovinos) que apresentam limitações translacionais. Este artigo descreve um novo modelo BBB bem baseado em inserção contendo apenas células humanas primárias (células endoteliais microvasculares cerebrais, astrócitos e pericitos vasculares cerebrais) permitindo a investigação de lesão cerebral isquêmica in vitro.

Os efeitos da privação de oxigênio-glicose (OGD) sobre a integridade da barreira foram avaliados pela permeabilidade passiva, medições de resistência elétrica transendotelial (TEER) e visualização direta de células hipóxicas. O protocolo apresentado oferece uma vantagem distinta que imita o ambiente intercelular do BBB in vivo, servindo como um modelo de BBB in vitro mais realista para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas no cenário de lesão cerebral isquêmica.

Introduction

O AVC é uma das principais causas de morte e incapacidade a longo prazo em todo o mundo¹. A incidência de AVC aumenta rapidamente com a idade, dobrando a cada 10 anos após os 55 anos². O acidente vascular cerebral isquêmico ocorre como resultado da ruptura do fluxo sanguíneo cerebral devido a eventos trombóticos e embólicos, que abrange mais de 80% de todos os casos de AVC³. Mesmo agora, existem relativamente poucas opções de tratamento disponíveis para minimizar a morte tecidual após acidente vascular cerebral isquêmico. Os tratamentos que existem são sensíveis ao tempo e, consequentemente, nem sempre levam a bons resultados clínicos. Portanto, a pesquisa sobre mecanismos celulares complexos de acidente vascular cerebral isquêmico que afetam a recuperação pós-AVC é urgentemente necessária.

O BBB é uma interface dinâmica para a troca de moléculas entre o sangue e o parênquima cerebral. Estruturalmente, o BBB é composto por células endoteliais microvasculares cerebrais interconectadas por complexos juncionais circundados por membrana basal, pericitos e extremidades astrocíticas⁴. Pericitos e astrócitos desempenham um papel essencial na manutenção da integridade do BBB através da secreção de vários fatores necessários para a formação de junções fortes e apertadas ^5,6. A quebra do BBB é uma das características do acidente vascular cerebral isquêmico. A resposta inflamatória aguda e o estresse oxidativo associados à isquemia cerebral resultam na ruptura de complexos proteicos de junção apertada e no crosstalk desregulado entre astrócitos, pericitos e células endoteliais, o que leva ao aumento da permeabilidade de solutos paracelulares em todo o BBB⁷. A disfunção do BBB promove ainda a formação de edema cerebral e aumenta o risco de transformação hemorrágica⁸. Considerando todos os itens acima, há grande interesse em compreender as alterações moleculares e celulares que ocorrem no nível BBB durante e após o AVC isquêmico.

Embora muitos modelos de BBB in vitro tenham sido desenvolvidos nas últimas décadas e utilizados em uma variedade de estudos, nenhum deles pode se replicar totalmente em condições in vivo ⁹. Enquanto alguns modelos são baseados em monocamadas de células endoteliais cultivadas em suportes permeáveis de inserção de poço isoladamente ou em combinação com pericitos ou astrócitos, apenas estudos mais recentes introduziram desenhos de modelos de cultura de células triplas. Quase todos os modelos de BBB de cultura tripla existentes incorporam células endoteliais cerebrais primárias, juntamente com astrócitos e pericitos isolados de espécies animais ou células derivadas de células-tronco pluripotentes humanas^10,11,12,13.

Reconhecendo a necessidade de recapitular melhor o BBB humano in vitro, estabelecemos um modelo de BBB in vitro de cultura de células triplas composto por células endoteliais microvasculares do cérebro humano (HBMEC), astrócitos humanos primários (HA) e pericitos vasculares cerebrais humanos primários (HBVP). Este modelo BBB de cultura tripla é configurado em inserções de membrana de poliéster de placa de 6 poços com tamanho de poro de 0,4 μm. Essas inserções de poço fornecem um ambiente ideal para a fixação celular e permitem fácil acesso aos compartimentos apicais (sangue) e basolateral (cérebro) para amostragem média ou aplicação de compostos. As características deste modelo BBB de cultura de células triplas proposto são avaliadas medindo-se TEER e fluxo paracelular pós-OGD imitando acidente vascular cerebral isquêmico in vitro, com uma escassez de oxigênio (<1% O₂) e nutrientes (usando meio livre de glicose) alcançada usando uma câmara umidificado e selada. Além disso, as condições isquêmicas induzidas neste modelo são verificadas com precisão pela visualização direta de células hipóxicas.

Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todas as células, materiais, equipamentos e soluções usados neste protocolo. 1. Configuração do modelo BBB de cultura de células triplas Semeadura de pericitosCultivar HBVP em frascos de cultura T75 com uma superfície ativada para adesão celular dentro de uma incubadora de CO2 a 5% a 37 °C até ficar confluente. Uma vez atingida a confluência, aspirar…

Representative Results

Para examinar os efeitos de astrócitos e pericitos sobre a função de barreira do HBMEC, construímos o modelo BBB de cultura de células triplas em inserções de cultura celular (Figura 1A), juntamente com a monocultura do HBMEC e dois modelos de cocultura dupla como controles (Figura 1B). Os controles de dupla cocultura incluíram uma cocultura sem contato do HBMEC com o AH e a cocultura de contato do HBMEC com o HBVP. Após 6 dias em co-cultura, todas as c…

Discussion

Neste protocolo, descrevemos um método para estabelecer um modelo confiável de cultura BBB de células endoteliais triplas de pericitos-astrócitos para estudar a disfunção de BBB no contexto de acidente vascular cerebral isquêmico in vitro. Considerando que os pericitos são os vizinhos mais próximos das células endoteliais in vivo, as HBVP são revestidas na parte inferior das inserções de poços neste modelo¹⁶. Embora essa configuração não tenha a comunicação dir…

Materials

24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert	Corning	3450
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek Life Sciences (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium	Science Cell	1801
Attachment Factor	Cell Systems (Fisher Scientific)	4Z0-201
BD 60 mL Syringe	BD	309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium	STEMCELL Technologies	5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost	4Z0-500	Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap	VWR	430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask	Corning	431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates	Corning	3340
Countes Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution	Fisher Scientific	04-355-71
Disposable Petri Dishes	VWR	25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)	ThermoFisher	A14430-01	Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium)	ThermoFisher	14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL	Lonza	CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes	World Precison Instruments	NC9792051	Epithelial voltohmmeter
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000)	Millipore Sigma	FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000)	Millipore Sigma	FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope	Olympus	FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2)	Airgas	X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)	Thermofisher	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570
Human Astrocytes	Science Cell	1800
Human Brain Vascular Pericytes	Science Cell	1200
Hypoxia Incubator Chamber	STEMCELL Technologies	27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent	ThermoFisher	I14834
Pericyte Medium	Science Cell	1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ACBRI 376	Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double	VWR	10860-658
Single Flow Meter	STEMCELL Technologies	27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader	Molecular Devices	75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile	NEST Scientific	380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells)	MidSci	TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks	MidSci	TP90075	Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056
UltraPure Distilled Water	Invitrogen (Life Technologies)	10977-015
Uno Stage Top Incubator-	Oko Lab	UNO-T-H-CO2-TTL