Een verrijkingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel
Summary
Hier beschrijven we de verrijking van kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel door middel van een geoptimaliseerde differentiële ultracentrifugatiemethode.
Abstract
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV’s) afgeleid van weefsel kunnen de functionele status van de broncellen en de kenmerken van de interstitiële ruimte van het weefsel weerspiegelen. De efficiënte verrijking van deze sEV’s is een belangrijke voorwaarde voor de studie van hun biologische functie en een sleutel tot de ontwikkeling van klinische detectietechnieken en therapeutische dragertechnologie. Het is moeilijk om sEV’s uit weefsel te isoleren omdat ze meestal zwaar verontreinigd zijn. Deze studie biedt een methode voor de snelle verrijking van hoogwaardige sEV’s uit leverkankerweefsel. De methode omvat een proces in vier stappen: de incubatie van spijsverteringsenzymen (collagenase D en DNase Ι) met weefsel, filtratie door een 70 μm celzeef, differentiële ultracentrifugatie en filtratie door een membraanfilter van 0,22 μm. Door de optimalisatie van de differentiële ultracentrifugatiestap en de toevoeging van een filtratiestap is de zuiverheid van de sEV’s die met deze methode worden verkregen hoger dan die van klassieke differentiële ultracentrifugatie. Het biedt een belangrijke methodologie en ondersteunende gegevens voor de studie van weefsel-afgeleide sEV’s.
Introduction
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV’s) hebben een diameter van ongeveer 30 nm tot 150 nm en worden uitgescheiden door verschillende cellen1. Ze kunnen communiceren met weefselcellen en de lokale of verre micro-omgeving reguleren door belangrijke biologische moleculen zoals lipiden, eiwitten, DNA en RNA naar verschillende organen, weefsels, cellen en intracellulaire delen te transporteren. Zo kunnen ze ook het gedrag van ontvangende cellen veranderen 2,3. De isolatie en zuivering van specifieke sEV’s is een essentiële voorwaarde voor het bestuderen van hun biologische gedrag tijdens de ontwikkeling en het verloop van de ziekte. Differentiële ultracentrifugatie – beschouwd als de gouden standaard – wordt vaak gebruikt om sEV’s te scheiden van de weefsels waarin ze zich normaal bevinden4. Weefselresten, celresten, grote blaasjes en apoptotische lichamen kunnen met deze techniek worden verwijderd, waardoor alleen de sEV’s overblijven.
Van collagenase D en DNase I is aangetoond dat ze de moleculaire kenmerken van cellen of blaasjes niet beïnvloeden, waarbij de eigenschappen van beide enzymen bijdragen aan de afgifte van blaasjes in de extracellulaire matrix 5. Deze enzymen zijn gebruikt om sEV’s te extraheren uit menselijk gemetastaseerd melanoomweefsel, darmkankerweefsel en darmslijmvliesweefsel 5,6,7. De concentratie en verteringstijd van collagenase D en DNase I in deze methoden verschillen echter, wat leidt tot inconsistente conclusies. Om de coprecipitatie van andere subtypen van sEV’s te voorkomen, hebben onderzoekers grotere extracellulaire blaasjes (0,1 μm of 0,2 μm in diameter) verwijderd door filtratie en / of differentiële centrifugatie8. Afhankelijk van het bronweefsel kunnen verschillende methoden van isolatie en zuivering nodig zijn 9,10.
Het gebruik van de traditionele differentiële ultracentrifugatiemethode om sEV’s uit leverweefsel te extraheren, resulteert in een laag witte stof op het oppervlak van het supernatant, zonder enige manier om de eigenschappen ervan te bepalen. In een eerdere studie11 bleek deze laag witte stof de zuiverheid van de sEV’s te beïnvloeden. Hoewel het aantal deeltjes en de eiwitconcentratie van monsters die met de traditionele methode werden geïsoleerd hoger waren dan die van de huidige methode, was de variatiecoëfficiënt groot, mogelijk omdat veel verontreinigende stoffen kunnen leiden tot een slechte herhaalbaarheid van de resultaten. Dat wil zeggen, met behulp van detergent (d.w.z. het detecteren van de oplosbaarheid van deeltjes in 1% Triton X-100), vonden we dat de zuiverheid van sEV’s verkregen door deze methode groter was. Daarom gebruiken we deze methode om sEV’s afgeleid van colorectaal kankerweefsel te isoleren en te zuiveren voor proteomisch onderzoek.
Op dit moment is het onderzoek naar sEV’s bij leverkanker voornamelijk gericht op serum, plasma en het supernatant van de celcultuur12,13,14. SEV’s afgeleid van leverkankerweefsel kunnen echter nauwkeuriger de fysiologische pathologie en de omliggende micro-omgeving van leverkanker weerspiegelen en effectief de afbraak en vervuiling van andere EV’s voorkomen15,16. Met het gebruik van differentiële ultracentrifugatie kan deze methode de opbrengst verrijken en hoogwaardige sEV’s verkrijgen, wat een belangrijke basis vormt voor de verdere studie van leverkanker. Deze methode maakt het mogelijk om het leverkankerweefsel te scheiden door scherpe scheiding en te worden gedissocieerd door collagenase D en DNase I. Vervolgens worden het cellulaire puin, grote blaasjes en apoptotische lichamen verder verwijderd door filtratie en differentiële ultracentrifugatie. Ten slotte worden de sEV’s geïsoleerd en gezuiverd voor latere studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een herhaalbare methode voor het extraheren van sEV’s uit leverkankerweefsel. Hoogwaardige sEV’s worden verkregen door scherpe weefselisolatie, behandeling met spijsverteringsenzymen, differentiële ultracentrifugatie en 0,22 μm filtermembraanfiltratie en -zuivering. Voor downstream-analyse is het uiterst belangrijk om de hoge zuiverheid van de sEV’s te waarborgen. Tijdens het proces van differentiële centrifugatie verschijnt een laag witte stoffen (onbekende samenstelling) op het oppervlak van …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken het First Affiliated Hospital van Gannan Medical University voor het ondersteunen van dit werk. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 82260422).
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
Riferimenti
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
