간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포체의 농축 방법
Summary
여기에서는 최적화된 차등 초원심분리 방법을 통해 간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포의 농축을 설명합니다.
Abstract
조직에서 유래한 작은 세포외 소포(sEV)는 소스 세포의 기능 상태와 조직의 간질 공간의 특성을 반영할 수 있습니다. 이러한 sEV의 효율적인 농축은 생물학적 기능 연구의 중요한 전제 조건이며 임상 검출 기술 및 치료용 운반체 기술 개발의 핵심입니다. sEV는 일반적으로 심하게 오염되어 있기 때문에 조직에서 분리하기가 어렵습니다. 이 연구는 간암 조직에서 고품질 sEV를 빠르게 농축하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 소화 효소(콜라게나제 D 및 DNase Ι)를 조직과 배양하고, 70μm 세포 여과기를 통한 여과, 차등 초원심분리, 0.22μm 멤브레인 필터를 통한 여과의 4단계 공정을 포함합니다. 차동 초원심분리 단계의 최적화와 여과 단계의 추가로 인해, 이 방법에 의해 얻어진 sEV의 순도는 고전적인 차동 초원심분리에 의해 달성된 것보다 더 높다. 조직 유래 sEV 연구를 위한 중요한 방법론과 지원 데이터를 제공합니다.
Introduction
작은 세포외 소포체(sEV)는 직경이 약 30nm에서 150nm이며 다양한 세포에서 분비된다1. 그들은 지질, 단백질, DNA 및 RNA와 같은 중요한 생물학적 분자를 다양한 기관, 조직, 세포 및 세포 내 부분으로 운반하여 조직 세포와 통신하고 국소 또는 먼 미세 환경을 조절할 수 있습니다. 따라서, 그들은 또한 수신자 셀(2,3)의 동작을 변경할 수 있다. 특정 sEV의 분리 및 정제는 질병의 발달 및 경과 동안 생물학적 거동을 연구하기 위한 필수 전제 조건입니다. 금본위제로 간주되는 차등 초원심분리는 일반적으로 sEV가 일반적으로 상주하는 조직에서 분리하는 데 사용됩니다4. 조직 파편, 세포 파편, 큰 소포 및 세포 사멸체는 이 기술로 제거할 수 있으며 sEV만 남습니다.
콜라게나제 D와 DNase I은 세포나 소포의 분자적 특성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 두 효소의 특성은 세포외 기질에서 소포의 방출에 기여한다 5. 이 효소는 인간 전이성 흑색종 조직, 결장암 조직 및 결장 점막 조직에서 sEV를 추출하는 데 사용되었습니다 5,6,7. 그러나 이러한 방법에서 콜라게나제 D와 DNase I의 농도와 소화 시간이 다르기 때문에 일관성 없는 결론이 도출됩니다. 다른 유형의 sEV가 공침되는 것을 피하기 위해, 연구자들은 여과 및/또는 차등 원심분리를 통해 더 큰 세포밖 소포(직경 0.1 μm 또는 0.2 μm)를 제거했다8. 근원 조직에 따라, 다른 분리 및 정제 방법이 요구될 수 있다 9,10.
전통적인 차등 초원심분리 방법을 사용하여 간 조직에서 sEV를 추출하면 상등액 표면에 백질층이 생성되지만 그 특성을 결정할 방법이 없습니다. 이전 연구11에서 이 백질층은 sEV의 순도에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다. 기존 방법으로 분리한 샘플의 입자 수와 단백질 농도는 현재 방법보다 높았지만 변동 계수가 컸는데, 이는 많은 오염 물질이 결과의 반복성을 저하시킬 수 있기 때문일 수 있습니다. 즉, 세제를 사용하여(즉, 1% Triton X-100에서 입자의 용해도를 검출), 이 방법으로 얻은 sEV의 순도가 더 크다는 것을 발견했습니다. 따라서 우리는 이 방법을 사용하여 단백체 연구를 위해 대장암 조직에서 파생된 sEV를 분리하고 정제합니다.
현재 간암에서 sEV에 대한 연구는 주로 혈청, 혈장 및 세포 배양의 상층액12,13,14에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 간암 조직에서 유래한 sEV는 간암의 생리학적 병리 및 주변 미세 환경을 보다 정확하게 반영할 수 있으며 다른 EV의 분해 및 오염을 효과적으로 방지할 수 있습니다15,16. 차등 초원심분리를 사용하여 이 방법은 수율을 높이고 고품질 sEV를 얻을 수 있어 간암에 대한 추가 연구를 위한 중요한 기반을 제공합니다. 이 방법은 간암 조직이 날카로운 분리에 의해 분리되고 콜라게나제 D와 DNase I에 의해 해리될 수 있도록 합니다. 그런 다음 세포 파편, 큰 소포 및 세포 사멸체는 여과 및 차등 초원심분리에 의해 추가로 제거됩니다. 마지막으로, sEV는 이후 연구를 위해 분리 및 정제됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 간암 조직에서 sEV를 추출하는 반복 가능한 방법을 설명합니다. 고품질 sEV는 날카로운 조직 분리, 소화 효소 처리, 차등 초원심분리, 0.22μm 필터 멤브레인 여과 및 정제를 통해 얻을 수 있습니다. 다운스트림 분석의 경우 sEV의 고순도를 보장하는 것이 매우 중요합니다. 차등 원심 분리 과정에서 상청액 표면에 백색 물질 층 (알려지지 않은 조성)이 나타납니다. 이 층은 sEV를 오염시킬 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 이 작업을 지원해 준 간난 의과대학 제1부속병원에 감사를 표한다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 82260422)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
Riferimenti
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
