Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques
Summary
Un protocole pour l’induction et l’analyse de pièges extracellulaires (TNE) in vitro est présenté. La quantification de l’ADN, de la cathélicidine (LL37) et de l’activité enzymatique a fourni des données qui montrent la variabilité de la composition et de la morphologie des TNE induites par des stimuli microbiens et chimiques dans des conditions contrôlées similaires.
Abstract
Les neutrophiles fonctionnent comme la première ligne de défense cellulaire dans une réponse immunitaire innée en utilisant divers mécanismes, tels que la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Cette étude analyse les changements morphologiques et compositionnels des TNE induits par des stimuli microbiens et chimiques à l’aide de méthodologies in vitro normalisées pour l’induction et la caractérisation des TNE avec des cellules humaines. Les procédures décrites ici permettent d’analyser la morphologie (lytique ou non lytique) et la composition des NET (structures ADN-protéines et activité enzymatique), ainsi que l’effet des facteurs solubles ou du contact cellulaire sur ces caractéristiques. De plus, les techniques décrites ici pourraient être modifiées pour évaluer l’effet des facteurs solubles exogènes ou du contact cellulaire sur la composition des TNE.
Les techniques appliquées comprennent la purification de cellules polymorphonucléaires du sang périphérique humain à l’aide d’un double gradient de densité (1,079-1,098 g / mL), garantissant une pureté et une viabilité optimales (≥ 95%), comme démontré par la coloration de Wright, l’exclusion du bleu de trypan et la cytométrie en flux, y compris l’analyse FSC versus SSC et la coloration 7AAD. La formation de TNE est induite par des stimuli microbiens (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Candida albicans) et chimiques (acétate de myristate de phorbol, HOCl), et les TNE sont caractérisées par une coloration de l’ADN-DAPI, une immunocoloration pour le peptide antimicrobien cathélicidine (LL37) et une quantification de l’activité enzymatique (élastase neutrophile, cathepsine G et myéloperoxydase). Les images sont acquises par microscopie à fluorescence et analysées avec ImageJ.
Introduction
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine, jouant un rôle essentiel lors de la clairance des agents pathogènes par plusieurs mécanismes, dont la libération de grandes structures chromatiniques composées d’ADN et de plusieurs protéines antibactériennes nucléaires, cytoplasmiques et granulaires 1,2. L’antécédent direct décrivant ce rôle antimicrobien des neutrophiles a été fait par Takei et al.3 en 1996. Ces auteurs ont rapporté une nouvelle forme de mort différente de l’apoptose et de la nécroptose chez les neutrophiles, ont montré des changements morphologiques présentant une rupture nucléaire, suivie d’un débordement du nucléoplasme dans le cytoplasme, et une augmentation de la perméabilité de la membrane à partir de 3 h d’incubation avec l’acétate de myristate de phorbol (PMA)2,3. Cependant, ce n’est qu’en 2004 que le terme « pièges extracellulaires (TNE) » a été utilisé4.
La formation de TNE a été observée dans diverses conditions, telles que les infections bactériennes, fongiques5, virales6 et parasitaires, pour neutraliser, tuer et prévenir la dissémination microbienne7. D’autres études montrent qu’il peut également se produire dans des conditions non pathogènes par des stimuli stériles, tels que des cytokines, des cristaux d’acide urique monosodique ou de cholestérol, des auto-anticorps, des complexes immunitaires et des plaquettes activées7. Le lipopolysaccharide (LPS), l’interleukine-8 (IL-8) et la PMA ont été parmi les premiers stimuli in vitro décrits comme des inducteurs NET, et l’implication in vivo des TNE dans les processus pathogènes a été démontrée dans deux modèles d’inflammation aiguë : la dysenterie expérimentale et l’appendicite humaine spontanée4. L’ADN est une composante essentielle de la TNE. Sa structure et sa composition appropriées sont nécessaires à la séquestration et à la destruction des micro-organismes en délivrant une forte concentration locale de molécules antimicrobiennes vers les microbes capturés, comme le démontre un bref traitement par désoxyribonucléase (DNase) qui désintègre les TNE et leurs propriétés microbicides4. Outre l’ADN, les TNE comprennent des protéines attachées telles que les histones, l’élastase neutrophile (NE), la cathepsine G (CG), la protéinase 3, la lactoferrine, la gélatinase, la myéloperoxydase (MPO) et les peptides antimicrobiens (AMP) tels que le peptide cationique pro-inflammatoire cathélicidine LL-37, entre autres, 8,9. Ces agrégats peuvent former des fils plus grands avec des diamètres allant jusqu’à 50 nm. Ces facteurs peuvent perturber les facteurs de virulence microbienne ou l’intégrité de la membrane cellulaire pathogène; de plus, les AMPs peuvent stabiliser l’ADN dérivé de NET contre la dégradation par les nucléases bactériennes10.
Les mécanismes spécifiques régulant la formation des TNE n’ont pas encore été complètement clarifiés. La voie la mieux caractérisée menant à la libération de NET est la signalisation ERK, qui conduit à l’activation de la NADPH oxydase et à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), ainsi qu’à une augmentation du calcium intracellulaire qui déclenche l’activation de la voie MPO. Cela transforme à son tour le peroxyde d’hydrogène en acide hypochloreux, activant NE par oxydation11,12. L’entérite nécrotique est responsable de la dégradation des filaments d’actine du cytosquelette pour bloquer la phagocytose et de leur translocation vers le noyau pour traitement par clivage protéolytique et désamination par PAD4 qui entraînent la désensibilisation des fibres de chromatine, qui s’associent aux protéines granulaires et cytoplasmiques, et sont ensuite libérées extracellulairement7. Ces protéases comprennent celles libérées par le complexe azurosome des granules azurophiles et d’autres protéases telles que la cathepsine G13.
Selon les changements morphologiques des neutrophiles, les TNE sont classées en deux types : la formation de TNE suicidaires ou lytiques conduisant à la mort cellulaire4, et la formation de TNE vitale ou non lytique produite par des cellules viables médiées par une libération vésiculeuse d’ADN nucléaire ou mitochondrial, avec un reste d’un cytoplaste anucléé ayant une capacité phagocytaire14,15. Généralement, les TNE composées d’ADN mitochondrial présentent une morphologie allongéede fibres 14, tandis que celles structurées d’ADN nucléaire ont une apparence nuageuse3. Cependant, on ne sait pas comment le neutrophile choisit son origine ADN. Contrairement aux études précédentes qui décrivaient les voies canoniques des TNE comme nécessitant plusieurs heures, la voie vitale est rapidement activée en seulement 5 à 60 minutes15.
Malgré ces avancées, la composition de l’EVF varie en fonction du stimulus; par exemple, différentes souches mucoïdes et non mucoïdes de P. aeruginosa induisent la formation de TNE contenant 33 protéines communes et jusqu’à 50 protéines variables7. Ainsi, il est nécessaire d’homogénéiser les techniques qui permettent la génération de conclusions objectives dans les groupes de recherche. Cet article décrit un protocole avec diverses techniques qui permettent de comparer et d’évaluer la composition, la structure et la morphologie des TNE induites par différents micro-organismes: Staphylococcus aureus (bactérie à Gram positif), Pseudomonas aeruginosa (bactérie à Gram négatif) et Candida albicans (champignon), ainsi que des stimuli chimiques (PMA, HOCl) dans les neutrophiles humains d’individus sains. Les résultats représentatifs démontrent l’hétérogénéité des TNE en fonction de leur stimulus inducteur dans des conditions in vitro comparables, caractérisées par la coloration de l’ADN-DAPI, l’immunomarquage pour LL37 et la quantification de l’activité enzymatique (NE, CG et MPO).
Protocol
Representative Results
Discussion
Une population très pure de neutrophiles viables doit être obtenue pour induire la libération de TNE, car ces cellules ont une durée de vie ex vivo limitée de 8 h en moyenne, période au cours de laquelle toutes les expériences doivent être effectuées. Pour cela, la méthodologie idéale est le gradient de double densité pour optimiser le temps de purification en isolant les cellules non activées plus sensibles à la stimulation exogène, contrairement au gradient de Ficoll-Histopaque ou aux techniques…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de science fondamentale (#285480) de CONACyT et par le Département de recherche en immunologie clinique de la Faculté des sciences biochimiques de l’Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L et W.J.R.R. ont des bourses doctorales de CONACyT numéros #799779, #660793 et #827788, respectivement.
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
Riferimenti
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