ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ”א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.
Abstract
נויטרופילים מתפקדים כקו ההגנה התאי הראשון בתגובה חיסונית מולדת על ידי הפעלת מנגנונים מגוונים, כגון היווצרות מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות (NETs). מחקר זה מנתח את השינויים המורפולוגיים והקומפוזיציוניים ב-NETs המושרים על-ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים תוך שימוש במתודולוגיות סטנדרטיות במבחנה להשראת NET ואפיון עם תאים אנושיים. ההליכים המתוארים כאן מאפשרים ניתוח של מורפולוגיה NET (ליטית או לא ליטית) והרכב (מבנים של חלבון DNA ופעילות אנזימטית), ואת ההשפעה של גורמים מסיסים או מגע תאי על מאפיינים אלה. בנוסף, ניתן לשנות את הטכניקות המתוארות כאן כדי להעריך את ההשפעה של גורמים מסיסים אקסוגניים או מגע תאי על הרכב NET.
הטכניקות המיושמות כוללות טיהור של תאים פולימורפונוקליאריים מדם היקפי אנושי באמצעות שיפוע בצפיפות כפולה (1.079-1.098 גרם/מ”ל), מה שמבטיח טוהר וכדאיות אופטימליים (≥ 95%) כפי שהוכח על ידי הכתמה, הרחקת טריפן כחול וציטומטריה של זרימה, כולל ניתוח FSC לעומת SSC וצביעת 7AAD. היווצרות NET מושרית באמצעות גירויים מיקרוביאליים (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ו-Candida albicans) וכימיים (phorbol myristate acetate, HOCl), וה-NETs מאופיינים בהכתמת DNA-DAPI, אימונוסטינינג לפפטיד האנטי-מיקרוביאלי קתליצידין (LL37), וכימות הפעילות האנזימטית (נויטרופיל אלסטאז, קתפסין G ומיאלופרוקסידאז). התמונות נרכשות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומנותחות באמצעות ImageJ.
Introduction
נויטרופילים הם הלויקוציטים הנפוצים ביותר בזרם הדם, הממלאים תפקיד חיוני במהלך פינוי סוכנים פתוגניים על ידי מספר מנגנונים, כולל שחרור מבני כרומטין גדולים המורכבים מ- DNA ומספר חלבונים אנטיבקטריאליים גרעיניים, ציטופלסמיים וגרגירים 1,2. ההקדמה הישירה המתארת את התפקיד האנטי-מיקרוביאלי הזה של נויטרופילים נעשתה על ידי Takei et al.3 בשנת 1996. מחברים אלה דיווחו על צורה חדשה של מוות שונה מאפופטוזיס ונקרופטוזיס בנויטרופילים, הראו שינויים מורפולוגיים המציגים קרע גרעיני, ולאחר מכן נשפך מתוך הנוקלאופלזמה לתוך הציטופלסמה, ועלייה בחדירות הממברנה מ-3 שעות של דגירה עם phorbol myristate אצטט (PMA)2,3. עם זאת, רק בשנת 2004 נעשה שימוש במונח “מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות (NETs)”4.
היווצרות NET נצפתה במצבים שונים, כגון חיידקים חיידקיים, פטרייתיים5, ויראליים6 וזיהומים טפיליים, לנטרול, הרג ומניעת הפצה מיקרוביאלית7. מחקרים אחרים מראים כי זה יכול להתרחש גם בתנאים לא פתוגניים על ידי גירויים סטריליים, כגון ציטוקינים, חומצת שתן מונוסודיום או גבישי כולסטרול, נוגדנים עצמיים, קומפלקסים חיסוניים, וטסיות מופעלות7. ליפופוליסכריד (LPS), אינטרלוקין-8 (IL-8) ו-PMA היו בין הגירויים הראשונים במבחנה שתוארו כמשרי NET, ומעורבות in vivo NET בתהליכים פתוגניים הודגמה בשני מודלים של דלקת חריפה: דיזנטריה ניסיונית ודלקת התוספתן האנושית הספונטנית4. דנ”א הוא מרכיב NET חיוני. המבנה וההרכב המתאימים שלו נחוצים לריצוף והרג של מיקרואורגניזמים על ידי העברת ריכוז מקומי גבוה של מולקולות אנטי-מיקרוביאליות לעבר המיקרובים שנתפסו, כפי שמודגם על ידי טיפול קצר בדאוקסיריבונוקלאז (DNase) המפרק את ה-NETs ואת תכונותיהם המיקרו-ביצידליות4. מלבד דנ”א, NETs מורכבים מחלבונים מחוברים כגון היסטונים, נויטרופיל אלסטאז (NE), קתפסין G (CG), פרוטאינאז 3, לקטופרין, ג’לטינאז, מיאלופרוקסידאז (MPO) ופפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) כגון הפפטיד הקטיוני מרובה הדלקת קתליצידין LL-37 בין היתר 8,9. אגרגטים כאלה עשויים ליצור חוטים גדולים יותר עם קטרים של עד 50 ננומטר. גורמים אלה יכולים לשבש את גורמי האלימות המיקרוביאלית או את שלמות קרום התא הפתוגן; בנוסף, ה-AMPs יכולים לייצב את הדנ”א שמקורו ב-NET מפני פירוק על-ידי נוקלאזות חיידקיות10.
המנגנונים הספציפיים המסדירים את היווצרות NET טרם הובהרו במלואם. המסלול המאופיין בצורה הטובה ביותר המוביל לשחרור NET הוא באמצעות איתות ERK, מה שמוביל להפעלת NADPH אוקסידאז ולייצור חמצן תגובתי (ROS), כמו גם לסידן תוך תאי מוגבר המפעיל הפעלה של מסלול MPO. זה בתורו הופך מי חמצן לחומצה היפוכלורית, ומפעיל את NE על ידי חמצון11,12. NE אחראי להשפלת חוטי האקטין של השלד הציטוסקולרי כדי לחסום פאגוציטוזה ולהעביר אותם לגרעין לצורך עיבוד על ידי ביקוע פרוטאוליטי ופירוק על ידי PAD4 המניעים את הדה-סנסיטיזציה של סיבי הכרומטין, המתקשרים לחלבונים גרגירים וציטופלסמיים, ולאחר מכן משתחררים באופן חוץ-תאי7. פרוטאזות אלה כוללות את אלה המשתחררות מקומפלקס האזורוזומים של גרגירי האזורופיל ופרוטאזות אחרות כגון קתפסין G13.
בהתאם לשינויים המורפולוגיים בנויטרופילים, NETs מסווגים לשני סוגים: היווצרות NET אובדנית או ליטית המובילה למוות תאי4, והיווצרות NET חיונית או לא ליטית המיוצרת על ידי תאים בני קיימא המתווכים על ידי שחרור שלפוחית של דנ”א גרעיני או מיטוכונדריאלי, עם שריד של ציטופלסט אנוקליע עם יכולת פאגוציטית14,15. באופן כללי, NETs המורכבים מדנ”א מיטוכונדריאלי מציגים מורפולוגיה של סיב14 מוארך, ואילו אלה המובנים מדנ”א גרעיני הם בעלי מראה דמוי ענן3. עם זאת, לא ידוע כיצד הנויטרופיל בוחר את מקור הדנ”א שלו. בניגוד למחקרים קודמים שתיארו את המסלולים הקנוניים של NETs ככאלה שדורשים מספר שעות, המסלול החיוני מופעל במהירות תוך 5-60 דקות15 דקות בלבד.
למרות ההתקדמות הזו, הרכב ה-NET משתנה בהתאם לגירוי; לדוגמה, זנים שונים של רירית ולא רירית של P. aeruginosa גורמים להיווצרות NETs המכילים 33 חלבונים נפוצים ועד 50 חלבונים משתנים7. לכן, יש צורך הומוגניות טכניקות המאפשרות הדור של מסקנות אובייקטיביות בקבוצות מחקר. מאמר זה מתאר פרוטוקול עם טכניקות שונות המאפשרות השוואה והערכה של הרכב, מבנה ומורפולוגיה של NETs המושרים עם מיקרואורגניזמים שונים: סטפילוקוקוס אאורוס (חיידק גראם חיובי), Pseudomonas aeruginosa (חיידק גראם שלילי) וקנדידה אלביקנס (פטרייה), כמו גם גירויים כימיים (PMA, HOCl) בנויטרופילים אנושיים מאנשים בריאים. התוצאות המייצגות מדגימות את ההטרוגניות של NETs בהתאם לגירוי הגורם שלהם בתנאים מקבילים במבחנה, המאופיינים בהכתמת DNA-DAPI, אימונוסטינינג עבור LL37 וכימות של פעילות אנזימטית (NE, CG ו- MPO).
Protocol
Representative Results
Discussion
יש להשיג אוכלוסייה טהורה ביותר של נויטרופילים בני קיימא כדי לגרום לשחרור של NETs מכיוון שלתאים אלה יש אורך חיים מוגבל של 8 שעות בממוצע, תקופה שבה יש לבצע את כל הניסויים. לשם כך, המתודולוגיה האידיאלית היא שיפוע הצפיפות הכפולה כדי לייעל את זמן הטיהור על ידי בידוד תאים לא פעילים המגיבים יות?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מדע בסיסי (#285480) מ- CONACyT ועל ידי המחלקה למחקר אימונולוגיה קלינית של הפקולטה למדעים ביוכימיים, אוניברסיטת אוטונומה ‘בניטו חוארס’ דה אואחאקה. ל-A.A.A, S.A.S.L ו-W.J.R.R. יש מלגות דוקטורט של מספרי CONACyT #799779, #660793 ו-#827788, בהתאמה.
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
Riferimenti
- De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
- Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
- Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
- Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
- Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
- White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).
