Summary
Delvis iskiasnerveligering inducerer langvarig kronisk neuropatisk smerte, karakteriseret ved overdrevne reaktioner på termiske og mekaniske stimuli. Denne musemodel af neuropatisk smerte bruges almindeligvis til at studere innovative terapier til smertebehandling. Denne artikel beskriver detaljeret den kirurgiske procedure for at forbedre standardisering og reproducerbarhed.
Abstract
Håndtering af kroniske smerter er stadig udfordrende den dag i dag, og nuværende behandlinger er forbundet med bivirkninger, herunder tolerance og afhængighed. Kronisk neuropatisk smerte skyldes læsioner eller sygdomme i det somatosensoriske system. For at undersøge potentielle terapier med reducerede bivirkninger er dyresmertemodeller guldstandarden i prækliniske undersøgelser. Derfor er velkarakteriserede og velbeskrevne modeller afgørende for udvikling og validering af innovative terapier.
Delvis ligering af iskiasnerven (pSNL) er en procedure, der inducerer kronisk neuropatisk smerte hos mus, kendetegnet ved mekanisk og termisk overfølsomhed, løbende smerte og ændringer i lemmernes temperatur, hvilket gør denne model til en god pasform til at studere neuropatisk smerte præklinisk. pSNL er en fordelagtig model til at studere neuropatisk smerte, da den reproducerer mange symptomer observeret hos mennesker med neuropatisk smerte. Desuden er den kirurgiske procedure relativt hurtig og ligetil at udføre. Ensidig pSNL af et lem muliggør sammenligning mellem de ipsilaterale og kontralaterale poter samt evaluering af central sensibilisering.
For at fremkalde kronisk neuropatisk overfølsomhed bruges en 9-0 ikke-absorberbar nylontråd til at ligere den dorsale tredjedel af iskiasnerven. Denne artikel beskriver den kirurgiske procedure og karakteriserer udviklingen af kronisk neuropatisk smerte gennem flere almindeligt anvendte adfærdstests. Da en overflod af innovative terapier nu undersøges til behandling af kroniske smerter, giver denne artikel afgørende begreber til standardisering og en nøjagtig beskrivelse af operationer, der kræves for at fremkalde neuropatisk smerte.
Introduction
Kroniske smerter er et væsentligt sundhedsproblem over hele verden og er et af de dyreste sundhedsproblemer i USA. Kroniske smerter styres bedre, når både farmakologiske og ikke-farmakologiske modaliteter anvendes på en tværfaglig måde1. Håndtering af kroniske smerter er udfordrende og behandler i nogle tilfælde ikke smertentilstrækkeligt 2. Derfor er der behov for nye og komplementære metoder til at forbedre kronisk smertebehandling, og dyremodeller er afgørende for at undersøge innovative terapier.
Kroniske neuropatiske smerter skyldes læsioner eller sygdomme i det somatosensoriske system, herunder diabetes, infektioner, nervekompressioner eller autoimmune sygdomme3. Neuropatisk smerte er afhængig af både perifere og centrale sensibiliseringsmekanismer og stammer fra en læsion af nerverne. Denne smerte kan karakteriseres ved både berørings- og termisk fremkaldt hyperalgesi og allodyni, vedvarende smerte og ændringer i temperaturen på det berørte lem4. For bedre at forstå mekanismerne og fremme nye behandlinger er der udviklet flere modeller hos gnavere for at efterligne symptomerne og årsagerne til neuropatisk smerte5. For eksempel kan neuropatisk smerte induceres med kemoterapeutiske middelinjektioner, spinalnerveligering (SNL), kronisk indsnævringsskade (CCI) af iskiasnerven, pSNL, skånet nerveskade, iskiasnervetranssektion og iskiasnervetrisektion6. Især reproducerer ligering af iskiasnerven flere træk ved neuropatisk smerte observeret hos mennesker, såsom mekanisk og termisk overfølsomhed eller ændringer i temperaturen på det berørte lem, der er karakteristisk for komplekst regionalt smertesyndrom (CRPS)7. Således er denne model velegnet til undersøgelse af CRPS eller andre nerveskader følelser, der fremkalder kronisk neuropatisk smerte. Modellen blev først udviklet af Seltzer i 19908 og bruges i vid udstrækning i smertestudier til at undersøge nye smertestillende forbindelser eller evaluere de kognitive virkninger af kroniske smerter 9,10,11,12,13. Modellen præsenterer høj reproducerbarhed, og den delvise ligering bevarer adfærdsmæssige reaktioner på perifere stimuli6.
Mange af de aktuelt anvendte modeller har mangler, der ikke er observeret i pSNL. CCI-modellen har en meget højere variation i skade mellem hvert dyr afhængigt af konstriktorens tæthed, og autotomi ændrer bagpotecifrene, hvilket gør modellen uegnet til adfærdsanalyse6. SNL-modellen er en langt mere kompliceret og længere operation, der ikke kun kræver avancerede tekniske færdigheder, men også medfører en høj risiko for alvorlige motoriske underskud3. Disse mangler ses ikke i pSNL-modellen. Den lette reproducerbarhed, den korte varighed af operationen og den reducerede risiko for motoriske underskud, der ses postoperativt, gør denne model værdifuld til at studere perifere neuropatiske smerter 8,14. Ikke desto mindre kan selve den partielle ligeringsprocedure have variabilitet mellem eksperimenter, hvilket resulterer i mindre konsistens i antallet af ligerede nervefibre. Derfor er det afgørende at præsentere detaljerne i operationen for at øge reproducerbarheden blandt undersøgelser.
For at inducere kronisk neuropati anvendes en 9-0 ikke-absorberbar nylonsutur til at ligere en tredjedel af bredden af iskiasnerven. Efter operationen er responserne på termiske og mekaniske stimuli overdrevne, startende på dag 1 postoperativt og varer mere end 50 dage8. Her blev både termiske og mekaniske følsomheder evalueret over 28 dage ved hjælp af Hargreaves', kogeplade- og von Frey-filamenttest. Alle adfærdsmæssige assays viste konsistensen af den langvarige overfølsomhed. Denne model har vist sig at have dosisafhængige virkninger af både morfin og ibuprofen, hvilket bekræfter, at den er velegnet til prækliniske smertestudier. Især beskriver denne artikel instruktionerne til et unikt håndlavet glasværktøj, kaldet "nerveglaskrog". Dette værktøj bruges i stedet for tang til at manipulere nerven og forhindre utilsigtet yderligere nerveskade under operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Arizona og er i overensstemmelse med retningslinjerne for brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health (NIH publikation nr. 80-23, 1966). Patogenfrie, voksne C57Bl6/J-mus (vægt ved test: 22-28 g) blev anbragt i standard vivarium-musebure (fem mus pr. bur) i klimakontrollerede rum i en 12 timers lys/mørk cyklus og fik adgang til mad og vand ad libitum. Alle adfærdsmæssige eksperimenter blev udført af eksperimenter, der var blinde for behandlingsbetingelserne.
1. Referencescenarie: måling af mekanisk følsomhed
- Ved ankomsten af musene, lad dem vænne sig til dyreanlægget i 1 uge. Derefter vænnes dyrene til forsøgshåndtering i ≥7 dage derefter.
- Vænne musene til von Frey-testapparatet i 1 time før testning ved at placere dem i klare plexiglaskasser på et trådnet i samme rum som testrummet - helst med eksperimentatoren til stede i rummet under tilvænning.
- Udgangspunktet for tilbagetrækning af poter bestemmes ved hjælp af "op-og-ned"-metoden ved hjælp af von Frey-filamenter, der er beskrevet i supplerende tabel S1, begyndende med filamentet 3,61 (3,9 mN).
- Mål tilbagetrækningsresponsen på sondering af den midterste plantar bagpote med en række kalibrerede fine (von Frey) monofilamenter. Hver glødetråd påføres vinkelret én gang på plantaroverfladen af pSNL ipsilateral bagpote på dyrene, der holdes i ophængte trådnetbure. Evaluer mekanisk følsomhed ved hjælp af "op-og-ned" metode15: Bestem tilbagetrækningstærsklen ved sekventielt at øge eller mindske stimulusstyrken svarende til filamentets størrelse. Påfør hver filament sekventielt én gang.
BEMÆRK: Forsøgspersonen skal undgå at stimulere nogen af trædepuderne for at opnå ensartede resultater mellem dyrene. - For eksempel, hvis dyret ikke reagerer på 3,61-filamentet, skal du bruge det tykkere 4,08-filament (9,8 mN) (et svar noteres visuelt som tilbagetrækning, rystelse eller slikning af den berørte pote); Hvis dyret reagerede første gang, skal du bruge det tyndere 3,22 (1,6 mN) filament. Fortsæt med at bruge enten faldende eller stadig tykkere filamenter afhængigt af om dyret havde henholdsvis positive eller negative efterfølgende reaktioner. Indberet negative og positive svar i databladet i supplerende tabel S1. Test den samme pote 4x med forskellige filamenter efter det første positive svar.
- Mål tilbagetrækningsresponsen på sondering af den midterste plantar bagpote med en række kalibrerede fine (von Frey) monofilamenter. Hver glødetråd påføres vinkelret én gang på plantaroverfladen af pSNL ipsilateral bagpote på dyrene, der holdes i ophængte trådnetbure. Evaluer mekanisk følsomhed ved hjælp af "op-og-ned" metode15: Bestem tilbagetrækningstærsklen ved sekventielt at øge eller mindske stimulusstyrken svarende til filamentets størrelse. Påfør hver filament sekventielt én gang.
2. Baseline: måling af termisk følsomhed ved hjælp af Hargreaves-testen
- Ved ankomsten af musene, lad dem vænne sig til dyreanlægget i 1 uge. Derefter vænnes dyrene til forsøgshåndtering i ≥7 dage derefter.
- Vænne musene til Hargreaves-testapparatet i 1 time før testning ved at placere dem i klare plexiglaskasser i samme rum som testrummet - helst med eksperimentatoren til stede i rummet under tilvænning.
BEMÆRK: Hargreaves-testen kræver, at dyret står stille i et par sekunder. Med mus er tilvænning nøglen til et vellykket eksperiment. Således, hvis musene forbliver meget aktive efter 1 times tilvænning, skal du lade dem akklimatisere sig længere efter behov.- Bestem poteudtagningsventetider som beskrevet af Hargreaves et al.16. Akklimatisere musene i plexiglaskabinetter på en klar plexiglasplade.
- Fokuser en strålevarmekilde (højintensitetsprojektorlampe) på plantaroverfladen af bagpoten ipsilateral til pSNL. Juster intensiteten af varmekilden for at opnå en baseline for poteudtagningslatenstid på ca. 10 s. Hold derefter intensiteten konstant i resten af eksperimentet.
- Vent på, at en bevægelsesdetektor automatisk stopper stimulus og timer, når poten trækkes tilbage. Brug en maksimal afskæring på 33,5 s for at forhindre vævsskade.
BEMÆRK: Afskæringen bestemmes ud fra tidligere eksperimenter og artikler for at undgå yderligere hudskader11,17,18. Med den intensitet, der anvendes i denne undersøgelse, er 33,5 afskæringen, svarende til en stimulusintensitet på 30 (50 W) ved anvendelse af Hargreaves-apparatet. Den observerede adfærd er en refleksadfærd, ikke en frivillig. - Basislinjepotetilbagetrækningslatenserne ved hjælp af Hargreaves-apparatet og sigte mod plantaroverfladen af pSNL ipsilateral bagpote. Start termisk stimulering og registrer tilbagetrækningsforsinkelse. For at undgå at påvirke temperaturen på varmestimuleringen skal du rense urin under forsøgene.
3. Baseline: måling af varmefølsomhed ved hjælp af varmepladetesten
- Dyrene vænnes til prøvelokalet i 1 time før testning.
BEMÆRK: Da stuetemperatur er vigtig og kan påvirke responsen på kogepladetesten, skal du sørge for, at rummets temperatur konstant er omkring 22 °C i tilvænningsperioden og gennem testperioden. - Indstil kogepladen til 52 °C, da denne temperatur har vist sig ideelt set at fremkalde en aversiv termisk respons19.
- Placer dyret i testkammeret og start et kronometer.
- Overhold for nocifensive adfærd (dvs. pote tilbagetrækning, slikning, rystelse). Da pSNL-operationen påvirker bagbenet, skal du se bort fra enhver adfærd, der observeres i forbenene (især slikning af forbenet).
- Stop kronometeret, så snart nocifensive adfærd observeres.
- Fjern dyret fra kammeret og registrer latenstiden til denne adfærd.
BEMÆRK: Fjern dyrene fra kammeret efter maksimalt 30 s for at forhindre vævsskade. Derudover er det vigtigt at bemærke, at den observerede adfærd er en refleksadfærd, ikke en frivillig. - Rengør testkammeret med 70% ethanol mellem dyr for at reducere lugtens adfærdsmæssige indvirkning. For at undgå at påvirke temperaturen på varmestimuleringen skal apparatet rengøres for urin mellem hvert testet dyr.
- For at bekræfte resultaterne optages videoer af dyrene i kogepladekammeret under testning til gennemgang, efter at dyrene er blevet testet.
BEMÆRK: Ved at bruge videogennemgang til at kvantificere latenstider kan eksperimentatoren gentagne gange observere testen og nøje analysere nocifensive adfærd, der kan være gået glip af under observation i realtid.
4. Præoperativ forberedelse
BEMÆRK: Sørg for, at der er rene bure til rådighed til genopretning af musene efter operationen. Rengør det kirurgiske område med 70% ethanol, desinficer hænderne med 70% ethanol, brug sterile handsker, brug korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) (laboratoriefrakke, hårnet, skoovertræk) og øv sterile teknikker under hele operationen.
- Forbered værktøjerne (supplerende figur S1) og yderligere ressourcer (gaze), der skal bruges i kirurgi ved at autoklavere dem på forhånd.
- Inducer anæstesi ved hjælp af flygtig isofluran og juster efter behov for at opretholde et kirurgisk plan. Sørg for, at ilt har en passende strømningshastighed.
- For at sikre, at dyret bedøves, skal du klemme tæerne på en bagpote med pincet for at sikre fraværet af poterefleks og kontrollere hornhindeblinkrefleksen, inden du påfører smørende oftalmisk salve.
BEMÆRK: Analgetika kan ikke tilbydes i denne undersøgelse, da de kan ændre smertevejen, der er beregnet til at blive analyseret, eller endda neutralisere og ugyldiggøre den adfærd, der måles i overensstemmelse med smerteforskningsmål20,21,22. - Når du vælger, hvilken side operationen skal udføres på (venstre er demonstreret her), barberes dyrets bagben omkring lårregionen, ringere mod patellaen, overlegent mod hoften og over lårbenet. Tør 3x med chlorhexidin i en retning med tre separate gasbind, skiftevis med varmt sterilt saltvand.
BEMÆRK: Fremadrettet skal du sikre, at hvert dyr får operationen udført på samme side for at opretholde konsistens. - Slip benet gennem en slids lavet i en 10 cm x 10 cm steril drapering for at skabe et sterilt felt omkring det valgte ben.
5. Kirurgisk procedure
- Brug en finkirurgisk saks (supplerende figur S1F) til at lave et lille 2 mm snit af huden i midterlinjen af lårets laterale aspekt. Skub saksen under huden i en cirkulær bevægelse for at bryde igennem fascia og skabe en clearance, der forstørrer snitrummet.
- Brug bindingspincet (supplerende figur S1H) til at skabe et skarpt snit lodret i en 90° vinkel i lårmusklerne, 1 cm dyb.
- Indsæt den fine lille saks (supplerende figur S1G) i det samme snit, også i en 90° vinkel, og spred dem forsigtigt op for at adskille musklerne. Fortsæt med at gøre dette, indtil iskiasnerven er visualiseret.
- Find iskiasnerven, som kan virke blank og tynd, løber parallelt med det lodrette lår, i retning af hoften til knæet. Fjern saksen og bindingspincetten fra kroppen, inden du fortsætter.
- Brug den ekstra fine tang (supplerende figur S1D) og nerveglaskrogen (supplerende figur S1E) til at isolere nerven nedefra. Frigør forsigtigt nerven fra omgivende bindevæv på et sted nær lårbenets trochanter, som er tættest på hoften og længst væk fra knæet.
- Lad nerven hvile på glasstangen, og sørg for, at enden af stangen forhindrer nerven i at rulle af.
- Placer en kirurgisk knude for at binde 1/3 af bredden af iskiasnerven ved hjælp af en 9-0 nylonsutur, inden den opdeles i de fælles peroneale, tibiale og kirurgiske nervegrene3.
BEMÆRK: Forgreningen sker som iskiasnerven kurser ned knæet, væk fra hoften. Da disse tre grene af nerven har tre forskellige innerveringer, er det bydende nødvendigt at placere den kirurgiske knude før forgreningen for at sikre de samme nerveunderskud på tværs af alle dyreoperationer. - Sørg for at holde trådene tæt på knuden, når du trækker trådene stramt, for ikke at trække i nerven med overdreven kraft for at undgå at glide nerven af glasstangen og undgå yderligere strækskader.
- Slip forsigtigt nerven af glasstangen, når knuden er færdig, og stik den tilbage på den oprindelige placering på niveauet under de adskilte muskler.
- Sutur muskelsnittet ved hjælp af en absorberbar polyglycolic 5-0 sutur. Sutur huden separat ved hjælp af en ikke-absorberbar polypropylen 6-0 sutur.
- Optag stoptiden for operationen og anæstesi. Lad musen vågne op, alene i et genopretningsbur, før du returnerer den til et nyt rent bur.
BEMÆRK: Under hele operationen skal du klemme dyrets tæer for at bekræfte tilstrækkelig vedligeholdelse af anæstesi og overvåge dets vejrtrækning og kropslige perfusion (rød, lyserød, bleg). Hvis vejrtrækningen er signifikant reduceret, eller dyret virker bleg, skal du overveje at reducere anæstesistrømmen eller øge iltstrømmen og have en sprøjte fyldt med saltvand klar til at injicere subkutant for at rehydrere dyret. På alle tidspunkter skal dyret have en varmekilde placeret under den for at opretholde kropsvarmen.
6. Fingeret kirurgi procedure for kontroldyr
- Følg trin 5.1-5.11 i den kirurgiske procedure; Udelad trin 5.4-5.9.
7. Postkirurgiske adfærdstest
BEMÆRK: Sørg for, at eksperimentatoren er blindet for enhver behandling. Kroniske neuropatiske smerter vil udvikle sig over 2 uger efter operationen, hvorefter adfærdsmæssige tests kan udføres efter administration af forbindelser af interesse.
- Brug von Frey, Hargreaves eller kogepladetesten til at evaluere både termisk og mekanisk overfølsomhed og dens potentielle vending.
- Fjern ethvert dyr fra undersøgelsen, hvis det opfylder effektparameterkriterierne som beskrevet af den institutionelle komité for dyrepleje og brug.
- Aflive dyrene efter procedurer beskrevet af den institutionelle dyrepleje- og brugskomité ved afslutningen af adfærdstesten.
8. Analyse af data
- von Frey:
- Analyser dataene ved hjælp af Dixons ikke-parametriske metode, som beskrevet af Chaplan og kolleger23, og udtryk dataene som den gennemsnitlige tilbagetrækningstærskel.
- På hovedsiden af den refererede software (se materialetabel) skal du vælge alle filamenter, der blev brugt til undersøgelsen (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 og 4.56). I gruppepanelet skal du vælge filamentet, der svarer til den sidste simulering. I det tomme felt skal du rapportere de positive (X ) og negative (o) svar. Skriv de tærskler, der er rapporteret i boksen til venstre for det observerede mønster af svar, ned.
BEMÆRK: Et eksempel på mønster og kvantificering er vist i supplerende figur S2.
- På hovedsiden af den refererede software (se materialetabel) skal du vælge alle filamenter, der blev brugt til undersøgelsen (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 og 4.56). I gruppepanelet skal du vælge filamentet, der svarer til den sidste simulering. I det tomme felt skal du rapportere de positive (X ) og negative (o) svar. Skriv de tærskler, der er rapporteret i boksen til venstre for det observerede mønster af svar, ned.
- Analyser dataene ved hjælp af Dixons ikke-parametriske metode, som beskrevet af Chaplan og kolleger23, og udtryk dataene som den gennemsnitlige tilbagetrækningstærskel.
- Hargreaves og kogeplade:
- Rapportér ventetiderne i et regneark til yderligere statistisk analyse.
- Resultaterne plottes som gennemsnittet af følsomhederne (tærskler eller latenstider) som funktion af tiden.
9. Instruktioner om, hvordan man laver nerveglaskrogen
BEMÆRK: Øv brandsikkerhed under hele denne proces. Brug korrekt beskyttelse, såsom varmebestandige handsker eller briller efter behov.
- Tænd for Bunsen-brænderen.
- Hold den ene ende af glasstangen (A) mod ilden i den ene hånd. Når denne glasstang smelter, skal du bruge en anden glasstang (B) i den anden hånd til at lede og trække i smelteglasset på stang A. Fjern glasstang A fra ilden, og lad enden af den smeltede del naturligt rulle indad for at danne en lille kugleform. Brug glasstangen B til at styre denne form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kroniske neuropatiske smerter blev induceret gennem delvis ligering af iskiasnerven hos C57Bl6/J hanmus (figur 1A). Mekanisk følsomhed blev evalueret ved hjælp af von Frey-filamenter og "op-og-ned" -metoden. Termisk følsomhed over for varme blev evalueret ved hjælp af Hargreaves og kogepladetest. Alle data blev analyseret med gentagne målinger tovejs ANOVA med Geisser-drivhuskorrektion for at sammenligne effekten af pSNL-kirurgi med falske dyr over tid eller virkningerne af forskellige doser morfin og ibuprofen.
Mus, der gennemgik pSNL-kirurgi, viste lavere tærskler for mekaniske stimuli sammenlignet med falske dyr over 28 dage (figur 1B). Lignende resultater blev opnået med termisk overfølsomhedsevaluering; potetilbagetrækningslatenstiden efter eksponering for strålevarmestimulus blev øget hos pSNL-dyr (figur 1C) såvel som tilbagetrækningslatenserne, når dyr blev anbragt på en 52 °C-plade (figur 1D).
Efter etableringen af kroniske neuropatiske smerter evaluerede vi 14 dage efter operationen de antinociceptive virkninger af forskellige doser morfin eller ibuprofen. Mus blev injiceret intraperitonealt med enten saltopløsning eller to forskellige doser morfin (1 og 5 mg/kg). Begge morfininjicerede grupper viste en reversering af pSNL-induceret overfølsomhed, som varede fra 1 (1 mg/kg) til 2 timer (5 mg/kg) (figur 2A). Den mekaniske overfølsomhed vendte tilbage til baseline 4 timer efter injektion af morfin. Når to forskellige doser ibuprofen (10 og 30 mg/kg) blev administreret intraperitonealt til musene, viste resultaterne nedsat mekanisk overfølsomhed sammenlignet med saltvandsinjicerede mus (figur 2B). De antinociceptive virkninger af ibuprofen varede op til 2 timer. Samlet set viste resultaterne, at pSNL-kirurgi fremkalder langvarig kronisk neuropatisk smerte. Desuden var vi i stand til at demonstrere, at denne model er følsom over for forskellige doser af smertestillende midler.
Figur 1: Langvarig termisk og mekanisk overfølsomhed hos mus på grund af delvis ligering af iskiasnerven. Termisk følsomhed over for varme (Hargreaves og kogepladetest) og mekanisk følsomhed over for von Frey-filamenter blev vurderet for at undersøge induktion og persistens af overfølsomhed i en model af kronisk neuropatisk smerte (pSNL). Baselineværdier blev målt før ligering af iskiasnerven, og overfølsomheden blev evalueret over 28 dage efter operationen. (A) Illustrationen repræsenterer den delvise ligering af iskiasnerven. (B) Mekaniske tilbagetrækningstærskler blev sammenlignet mellem skinmus og pSNL-mus på hvert tidspunkt. Gentagne målinger tovejs ANOVA med Geisser-drivhuskorrektion afslørede en signifikant effekt af pSNL (F (1, 10) = 222,3, p < 0,0001, n = 5-7 pr. Tilstand). Sidaks multiple sammenligningstest viste en signifikant stigning i overfølsomhed mellem dag 1 og 28 (p < 0,05). (C) Termiske tilbagetrækningslatenstider, målt ved Hargreaves-testen, blev sammenlignet mellem skin- og pSNL-mus. Gentagne målinger tovejs ANOVA med Geisser-drivhuskorrektion afslørede en signifikant effekt af pSNL (F(1 , 8) = 113,8; p < 0,0001, n = 4-6 pr. tilstand). Sidaks multiple sammenligningstest viste en signifikant stigning i overfølsomhed på dag 2 og 14 (p < 0,05). (D) Termiske tilbagetrækningstider, målt ved kogepladetesten, blev sammenlignet mellem skin- og pSNL-mus. Almindelig tovejs ANOVA afslørede en signifikant effekt af pSNL (F(1, 32) = 19,10, p = 0,0001, n = 4-6 pr. Tilstand). Sidaks multiple sammenligningstest viste en signifikant øget følsomhed over for varme 4 uger efter pSNL-operation (p = 0,0026). Data præsenteres som middelværdi ± S.E.M. Forkortelser: pSNL = delvis ligering af iskiasnerven; BL = udgangspunkt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Dosisafhængig reversering af pSNL-induceret mekanisk overfølsomhed ved intraperitoneal injektion af morfin eller ibuprofen. Mekanisk overfølsomhed (ved anvendelse af von Frey-filamenter) blev vurderet for at undersøge de potentielle antinociceptive virkninger af morfin eller ibuprofen i en musemodel af pSNL. Baselineværdier (præ-pSNL) blev erhvervet før iskiasnerveligering. Efter etablering af kroniske neuropatiske smerter blev dyrene på dag 14 baseline for anden gang for at sikre pSNL-induceret overfølsomhed (post-pSNL). Derefter blev to doser af enten morfin (1/5 mg/kg) eller ibuprofen (10/30 mg/kg) injiceret intraperitonealt. Potentiel reversering af mekanisk overfølsomhed blev vurderet over 4 timer efter injektioner. (A) Mekaniske tilbagetrækningstærskler blev sammenlignet mellem saltvandstilstanden og de to doser morfin. Gentagne målinger tovejs ANOVA med Geisser-drivhuskorrektion afslørede en signifikant effekt på 1 mg/kg morfin (F(1, 11) = 11,16, p = 0,0066, n = 6-7 pr. tilstand) og en signifikant effekt på 5 mg/kg morfin (F(1, 10) = 21,78, p = 0,0009, n = 6 pr. tilstand). Sidaks multiple sammenligningstest viste et signifikant fald i mekanisk overfølsomhed 1 time efter injektion for begge doser, men kun en signifikant effekt for 5 mg/kg tilstanden ved 2 timer (*p < 0,05). (B) Mekaniske tilbagetrækningstærskler blev sammenlignet mellem saltvandstilstanden og de to doser ibuprofen. Gentagne målinger tovejs ANOVA med Geisser-drivhuskorrektion afslørede en signifikant effekt på 10 mg/kg iburofen (F(1, 11) = 7,788, p = 0,0176, n = 6-7 pr. tilstand) og en signifikant effekt på 30 mg/kg ibuprofen (F(1, 10) = 18,79, p = 0,0015 , n = 6 pr. tilstand). Sidaks multiple sammenligningstest viste et signifikant fald i mekanisk overfølsomhed 1 og 2 timer efter injektion for begge doser (*p < 0,05). Data præsenteres som middelværdi ± S.E.M. Forkortelser: pSNL = delvis ligering af iskiasnerven; IP = intraperitoneal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Kirurgiske værktøjer. De to billeder illustrerer de forskellige værktøjer, der anvendes til operationen. (A) Fin Castroviejo-nåleholder; (B) Castroviejo nåleholder; c) Micro Adson tang; D) ekstra fine Graefe tang E) krog af nerveglas (F) fin saks (11,5 cm); G) fin saks (9 cm) H) bindepincet (I) iris tang. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Repræsentativt mønster af poteudtagningsrespons målt ved von Frey-filamenttesten. Til dette forsøg reagerede musen ikke på de første tre stimuleringer, men trak poten tilbage på den fjerde stimulering med 4,56-filamentet. Efter positivt svar (x) blev der anvendt et tyndere filament (4.31) efterfulgt af filamenter af mindre størrelse, indtil musen ikke reagerede på et andet filament (i dette tilfælde 4.08). Eksperimentatoren skal reducere filamenternes størrelse en efter en, indtil der ikke er respons (o). Efter et fravær af respons brugte eksperimentatoren et tykkere filament, indtil de opnåede et positivt respons og reducerede deres størrelse efter det positive respons (opnået her med 4.31-filamentet). Fire stimuli blev udført efter det første positive respons; det kronologiske mønster for hver stimulering er kommenteret med tal i rødt i panel A. I dette tilfælde blev filamenterne 2,44 til 3,22 aldrig brugt, da dyret ikke viste et positivt respons med 3,61-filamentet. (B) Reaktionsmønsteret blev derefter udfyldt i Allodynia-software, rapporteret i samme rækkefølge filamenterne blev påført (000xx0x0), i feltet fremhævet med hvidt. Den resulterende tærskel blev derefter beregnet af softwaren (2,60839). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S1: Dataindsamlingsark til von Frey-test. Denne tabel giver eksperimenter mulighed for at udfylde responsmønstre, når de bruger von Frey-filamenter. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behandling af kroniske smerter kræver ofte langvarig medicinering, hvilket gør smertebehandling udfordrende. Prækliniske modeller er således et vigtigt redskab til at evaluere de potentielle fordele ved innovative terapier, der er baseret på farmakologiske eller ikke-farmakologiske tilgange. De mange modeller af kronisk neuropatisk smerte medfører udfordringer på grund af øget variation i de kirurgiske teknikker blandt forskellige forskere, hvilket fører til reduceret reproducerbarhed. Det er således vigtigt at karakterisere de potentielle antinociceptive virkninger af nye terapier i flere modeller, der er velkarakteriserede og standardiserede.
Denne rapport viser, at den delvise ligering af iskiasnerven resulterer i udvikling af langvarige kroniske neuropatiske smerter hos mus ved hjælp af relativt billige metoder. pSNL overdriver reaktionerne på termiske og mekaniske stimuli, og modellen reagerer på administrationen af almindeligt anvendte smertestillende midler på en dosisafhængig måde. Derfor synes pSNL-modellen at være en bekvem og følsom model til at evaluere de potentielle fordele ved nye lægemidler. De primære egenskaber ved neuropatisk smerte er hyperalgesi og allodyni. Denne rapport viser, hvordan mekanisk allodyni og termisk hyperalgesi påvirkes. Imidlertid blev mekanisk hyperalgesi ikke målt. Der er et stort gråt område med overlapning mellem allodyni og hyperalgesi. Begge fornemmelser falder ind under paraplyen af generel overfølsomhed over for en sensorisk stimulus24. Således kan den stimulerede fornemmelse opfattes som en anden fornemmelse, såsom varme som kold smerte eller berøring som følelsen af at brænde. Derfor er hyperalgesi og allodyni ofte vanskelige at skelne mellem, især i dyresmertmodeller.
pSNL-modellen er blevet brugt i flere kroniske smerteundersøgelser til at evaluere effekten af smertestillende forbindelser, de underliggende mekanismer for kronisk smerte eller endda den kognitive virkning af langvarig neuropatisk smerte. Persistensen af mekanisk overfølsomhed i op til 70 dage gør det muligt at undersøge langtidsvirkningerne af nye lægemidler25. Det er vigtigt, at den optimale periode for adfærdstest omfatter den første, anden og tredje uge efter operationen, når kronisk smerte er etableret 8,11,26,27. For at evaluere styrken og effekten af et lægemiddel eller en ikke-farmakologisk terapi bør positive kontrolbehandlinger såsom morfin eller ibuprofen overvejes afhængigt af det eksperimentelle design. I modsætning til hale-flick-testen anvender kogepladetesten en stimulus på poten, der integrerer supraspinale veje19. Kogepladetesten har været meget udbredt til at karakterisere lægemiddelantinociceptive egenskaber i modeller af kronisk neuropatisk smerte i nyere undersøgelser 19,28,29,30,31,32,33.
Denne model blev brugt til at karakterisere nye ikke-opioide behandlinger og identificere en ny smertevej, der involverer neurotensinreceptor type 211,13. Det blev også brugt til at demonstrere involvering af glycinerge modulationer i kroniske smerter12 og udviklingen af nye terapier og veje i skæringspunktet mellem søvn og smerte10. Ikke desto mindre har ingen artikler til denne dag præsenteret en detaljeret forklaring af operationen suppleret med en beskrivende video.
En almindelig kritik af pSNL og lignende modeller er pålideligheden af konsistensen af graden af skade forårsaget af den neuropatiske nerveskade blandt dyr6. Denne artikel beskriver en procedure til manuelt at smelte og forme en glasstang for at skabe en speciel nerveglaskrog for at løse dette problem. De fleste dyreoperationer bruger tang til at afhente fine nerver eller kar. Nerveglaskrogværktøjet giver mulighed for en sikrere, mindre skade-tilbøjelig metode til at håndtere nerven. Selvom formålet med denne model er at skabe nerveskade, er det klogt at undgå yderligere skade på nerven bortset fra den, der er forårsaget af suturen placeret gennem en tredjedel af bredden af iskiasnerven. Nerveglaskrogen er en glat, ikke-skadelig overflade, som nerven kan hvile på; Derudover giver bolden/krogen i enden mulighed for nem opsamling og stabilisering. Ved suturering af nerven anbefaler teknikken beskrevet ovenfor (protokolafsnit note 5.7) at holde trådene dybt inde i kropshulrummet, tættest på hvor knuden vises. Dette undgår at trække i slutningen af suturerne og fremmer påføring af spænding på suturen tættest på nerven, når knuden strammes. Denne teknik forhindrer yderligere strækskader, hvis nerven utilsigtet skulle trækkes af nerveglaskrogen mod ydersiden af hulrummet i processen med at binde knuden strammere. En yderligere fordel er brugen af fin saks til at foretage det første snit. Dette giver mulighed for et meget mindre snitsted og dermed hurtigere heling i modsætning til de større snit lavet med skalpelblade.
De metoder, der er rapporteret i denne artikel, har også nogle begrænsninger. Udviklingen af kroniske smerter i pSNL-modellen påvirkes af dyrenes køn34. Derfor er det vigtigt, at forskningsundersøgelser inkluderer begge køn i deres analyse. Formålet med denne rapport var at fokusere på et kirurgisk indgreb og karakteriserede ikke seksuel dimorfisme af smertemodellen. Det er værd at nævne, at målinger af termisk følsomhed hos mus ved hjælp af Hargreaves-testen er udfordrende; Dyr skal stå stille i et lille kabinet i et par sekunder, mens stimulus påføres. Således er tilvænning af musene til plexiglaskabinettet en nøglefaktor for at opnå vellykkede resultater. Måling af fremkaldt smerte kræver også omhyggelig eksperimenttræning. Både fremkaldte og spontane adfærdstest anbefales til at evaluere den termiske og mekaniske følsomhed samt lemmernes funktionalitet. Derudover blev morfin og ibuprofen i denne undersøgelse anvendt som positive kontroller for antinociceptiv virkning. Disse to lægemidler blev valgt, da de almindeligvis anvendes som positive kontroller i flere smertemodeller og muliggør en bedre sammenligning mellem de forskellige modeller. Ikke desto mindre er det vigtigt at nævne, at pregabalin og gabapentin ofte ordineres til behandling af neuropatiske smerter, og undersøgelser med fokus på neuropatisk smertebehandling bør omfatte disse lægemidler som positive kontroller.
Denne rapport beskriver med præcision en operation, der almindeligvis anvendes til undersøgelse af kroniske neuropatiske smerter. At give forskere og praktikanter mulighed for at drage fordel af en visuel beskrivelse af denne musemodel vil lette udviklingen af forskningsprojekter, der fokuserer på at forstå mekanismerne bag kroniske smerter eller sigter mod karakterisering af innovative terapier. Desuden er brugen af flere smertemodeller afgørende for at forbedre reproducerbarheden, og denne rapport vil lette implementeringen af pSNL-modellen i nye laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at rapportere. Ingen af manuskriptets forfattere modtog vederlag eller godtgørelse eller honorar på anden måde. Forfatterne er ikke tilknyttet nogen leverandør eller farmaceutisk virksomhed, der er forbundet med denne undersøgelse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Center for Complementary and Integrative Health [R01AT009716, 2017] (M.M.I.), Comprehensive Chronic Pain and Addiction Center-University of Arizona (M.M.I.) og Medical Scientist Training Program (MSTP) ved University of Arizona, College of Medicine, Tucson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5/0, FS-2, 30" Undyed PGA Braided Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Suture | CP Medical | 421A | https://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/ |
| 6/0, P-1, 18" Blue Polypropylene Monofilament Non-Absorbable Suture | CP Medical | 8697P | https://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/ |
| 9/0 (0.3 metric) Nylon Black Monofilament Suture | Crestpoint Ophthalmics | MANI 1407 | https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html |
| Allodynia Software | National Instruments, LabView 2015 | Quantification of mean withdrawal thresholds (Von Frey data) | |
| C57Bl6/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
| Castroviejo needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14 |
| Cold Hot Plate Test | Bioseb | BIO-CHP | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html |
| Elevated metal mesh stand for Von Frey | Bioseb | BIO-STD2-EVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html |
| Extra fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110 |
| Fine Castroviejo needle holder | Simovision/Geuder | 17565 | https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf |
| Fine scissors (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14558-11 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11 |
| Fine scissors (9 cm) | Fine Science Tools | 14558-09 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09 |
| Iris forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07 |
| Micro Adson forceps | Fine Science Tools | 392487 | https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps |
| Modular holder cages for rats and mice | Bioseb | BIO-PVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html |
| Moretti/Effetre #240 Light Cobalt Blue glass rods 4 mm | Ebay | N/A | https://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS w9CtfnIVJ&amdata=enc %3AAQAHAAAAwCoqvgWRo NTe5Vq8PWOgfE4ygWeW4tL k81J1AFu%2Fkcbsk6pxYtJi6 digE5TL9SzlgMzYUMNDr%2B dku2%2B%2FEvB1qXqFmebE 020SGs9LPDXLL5w21un7jrM0 9xfWYvIzBYQYh6FRWyUJngC uuA9Bkjb9lxtZoYlg5y6PyFR2P 34xFk5xaNC5ib65M1%2Fr%2F 4w2Iw45QqsSyXH2cuUKRom0 AGBoBaIr%2BbJw1VnlMjGuc9dtx 4fbPbqoBNSWjj3RbZPOPTYS8Q %3D%3D%7Ctkp%3ABk9SR4q6- 6LfYA |
| Plantar Test for Thermal Stimulation - Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37570 | https://ugobasile.com/products/categories/pain-and-inflammation/plantar-test-for-thermal-stimulation |
| Touch-Test Sensory Evaluators, Set of 20 Monofilaments | North Coast Medical | NC12775-99 | https://www.ncmedical.com/products/touch-test-sensory-evaluators_1278.html |
| Tying forceps | Duckworth & Kent | 2-504ER8 | https://duckworth-and-kent.com/product/tying-forceps-9/ |
References
- Hassett, A. L., Gevirtz, R. N. Nonpharmacologic treatment for fibromyalgia: patient education, cognitive-behavioral therapy, relaxation techniques, and complementary and alternative medicine. Rheumatic Disease Clinics of North America. 35 (2), 393-407 (2009).
- Hylands-White, N., Duarte, R. V., Raphael, J. H. An overview of treatment approaches for chronic pain management. Rheumatology International. 37 (1), 29-42 (2017).
- Campbell, J. N., Meyer, R. A.
- Colloca, L., et al.
- Colleoni, M., Sacerdote, P. Murine models of human neuropathic pain. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (10), 924-933 (2010).
- Challa, S. R. Surgical animal models of neuropathic pain: Pros and cons. International Journal of Neuroscience. 125 (3), 170-174 (2015).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43 (2), 205-218 (1990).
- Hasnie, F. S., Wallace, V. C., Hefner, K., Holmes, A., Rice, A. S. Mechanical and cold hypersensitivity in nerve-injured C57BL/6J mice is not associated with fear-avoidance-and depression-related behaviour. British Journal of Anaesthia. 98 (6), 816-822 (2007).
- Ito, H., et al. Suvorexant and mirtazapine improve chronic pain-related changes in parameters of sleep and voluntary physical performance in mice with sciatic nerve ligation. PLoS One. 17 (2), 0264386 (2022).
- Martin, L., et al. Conotoxin contulakin-G engages a neurotensin receptor 2/R-type calcium channel (Cav2.3) pathway to mediate spinal antinociception. Pain. 163 (9), 1751-1762 (2021).
- Peiser-Oliver, J. M., et al. Glycinergic modulation of pain in behavioral animal models. Frontiers in Pharmacology. 13, 860903 (2022).
- Ramiro, I. B. L., et al. Somatostatin venom analogs evolved by fish-hunting cone snails: From prey capture behavior to identifying drug leads. Science Advances. 8 (12), (2022).
- Chung, J. M. Encyclopedia of Pain. Schmidt, R. F., Willis, W. D. , Springer. Berlin Heidelberg. 1299-1300 (2007).
- Zahn, P. K., Brennan, T. J. Primary and secondary hyperalgesia in a rat model for human postoperative pain. Anesthesiology. 90 (3), 863-872 (1999).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Yeomans, D. C., Proudfit, H. K. Characterization of the foot withdrawal response to noxious radiant heat in the rat. Pain. 59 (1), 85-94 (1994).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of thermal pain sensation in rats and mice using the Hargreaves test. Bio-Protocol. 7 (16), 2506 (2017).
- Hook, M. A., et al. The impact of morphine after a spinal cord injury. Behavioural brain research. 179 (2), 281-293 (2007).
- Loram, L. C., et al. Prior exposure to repeated morphine potentiates mechanical allodynia induced by peripheral inflammation and neuropathy. Brain, behavior, and immunity. 26 (8), 1256-1264 (2007).
- Green-Fulgham, S. M., et al. Oxycodone, fentanyl, and morphine amplify established neuropathic pain in male rats. Pain. 160 (11), 2634-2640 (2019).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurology. 13 (9), 924-935 (2014).
- Malmberg, A. B., Gilbert, H., McCabe, R. T., Basbaum, A. I. Powerful antinociceptive effects of the cone snail venom-derived subtype-selective NMDA receptor antagonists conantokins G and T. Pain. 101 (1-2), 109-116 (2003).
- Nakamura, Y., et al. Neuropathic pain in rats with a partial sciatic nerve ligation is alleviated by intravenous injection of monoclonal antibody to high mobility group box-1. PLoS One. 8 (8), 73640 (2013).
- Sherman, K., et al. Heterogeneity in patterns of pain development after nerve injury in rats and the influence of sex. Neurobiology of Pain. 10, 100069 (2021).
- Ba, X., et al. Cinobufacini protects against paclitaxel-induced peripheral neuropathic pain and suppresses TRPV1 up-regulation and spinal astrocyte activation in rats. Biomedicine Pharmacotherapy. 108, 76-84 (2018).
- Hao, Y., et al. Huachansu suppresses TRPV1 up-regulation and spinal astrocyte activation to prevent oxaliplatin-induced peripheral neuropathic pain in rats. Gene. 680, 43-50 (2019).
- Guo, J., et al. Effects of resveratrol in the signaling of neuropathic pain involving P2X3 in the dorsal root ganglion of rats. Acta Neurologica Belgica. 121 (2), 365-372 (2021).
- Ni, W., Zheng, X., Hu, L., Kong, C., Xu, Q. Preventing oxaliplatin-induced neuropathic pain: Using berberine to inhibit the activation of NF-kappaB and release of pro-inflammatory cytokines in dorsal root ganglions in rats. Experimental and Therapeutic Medicine. 21 (2), 135 (2021).
- Wang, J., et al. Selective activation of metabotropic glutamate receptor 7 blocks paclitaxel-induced acute neuropathic pain and suppresses spinal glial reactivity in rats. Psychopharmacology. 238 (1), 107-119 (2021).
- Sun, C., Wu, G., Zhang, Z., Cao, R., Cui, S. Protein tyrosine phosphatase receptor type D regulates neuropathic pain after nerve injury via the STING-IFN-I pathway. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 859166 (2022).
- Coyle, D. E., Sehlhorst, C. S., Mascari, C. Female rats are more susceptible to the development of neuropathic pain using the partial sciatic nerve ligation (PSNL) model. Neuroscience Letters. 186 (2-3), 135-138 (1995).
