Determinazione dell'efficienza di accoppiamento degli aploidi in Saccharomyces cerevisiae

Summary

In questo lavoro, viene descritto un metodo robusto per la quantificazione dell’efficienza di accoppiamento nel lievito Saccharomyces cerevisiae . Questo metodo è particolarmente utile per la quantificazione delle barriere prezigotiche negli studi di speciazione.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae è un organismo modello ampiamente utilizzato in genetica, evoluzione e biologia molecolare. Negli ultimi anni, è diventato anche un organismo modello popolare per studiare i problemi legati alla speciazione. Il ciclo di vita del lievito coinvolge sia le fasi riproduttive asessuate che sessuali. La facilità di eseguire esperimenti di evoluzione e il breve tempo di generazione dell’organismo consentono lo studio dell’evoluzione delle barriere riproduttive. L’efficienza con cui i due tipi di accoppiamento (a e α) si accoppiano per formare il diploide a/α è indicata come efficienza di accoppiamento. Qualsiasi diminuzione dell’efficienza di accoppiamento tra aploidi indica una barriera pre-zigotica. Pertanto, per quantificare l’entità dell’isolamento riproduttivo tra due aploidi, è necessario un metodo robusto per quantificare l’efficienza di accoppiamento. A tal fine, viene presentato qui un protocollo semplice e altamente riproducibile. Il protocollo prevede quattro fasi principali, che includono la rattoppo degli aploidi su una piastra YPD, la miscelazione degli aploidi in numero uguale, la diluizione e la placcatura per singole colonie e, infine, il calcolo dell’efficienza in base al numero di colonie su una piastra drop-out. I marcatori auxotrofi sono impiegati per fare chiaramente la distinzione tra aploidi e diploidi.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, comunemente chiamato lievito in erba, è un eucariota unicellulare. Ha due tipi di accoppiamento, uno e α, e presenta cicli riproduttivi sia asessuati che sessuali. I tipi di accoppiamento a e α sono aploidi e possono dividersi mitoticamente in assenza dell’altro tipo di accoppiamento nell’ambiente circostante, che rappresenta il ciclo asessuato del lievito. Quando i due tipi di accoppiamento sono nelle immediate vicinanze, smettono di dividersi mitoticamente e si fondono per formare una cellula diploide. Il lievito diploide può dividersi mitoticamente quando sono presenti sostanze nutritive o subire meiosi in condizioni di carenza di azoto in presenza di una fonte di carbonio povera che non è fermentabile, come l’acetato¹. Ciò si traduce nella formazione di spore, che rimangono dormienti fino a quando non ci sono condizioni di crescita favorevoli. Il ciclo vitale è completato quando queste spore germinano e i due tipi aploidi vengono rilasciati nel pool aploide ^2,3 (Figura 1).

L’accoppiamento delle cellule di lievito comprende diverse fasi, come l’agglutinazione, la formazione di una proiezione di accoppiamento o “shmoo”, seguita dalla fusione cellulare e nucleare ^4,5. I due tipi di accoppiamento a e α producono rispettivamente un fattore a e un fattore α per avviare l’accoppiamento. Questi fattori sono feromoni polipeptidici che si legano ai recettori (Ste2 e Ste3) presenti sulla superficie cellulare dell’accoppiamento opposto di tipo⁵. Il legame dei feromoni ai recettori avvia la via di risposta ai feromoni, la via di trasduzione del segnale della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) ^6,7,8. Ciò si traduce nell’arresto del ciclo cellulare nella fase G1, portando a una fase stazionaria metabolicamente attiva⁹. Le cellule quindi smettono di dividersi mitoticamente e le proteine necessarie per l’accoppiamento vengono sintetizzate. Poiché le cellule aploidi non possono muoversi l’una verso l’altra, una proiezione di accoppiamento o “shmoo” è diretta verso il partner di accoppiamento. Quando le cellule entrano in contatto, la parete cellulare viene degradata e il contenuto citoplasmatico si fonde, con conseguente accoppiamento per formare una cellula diploide^10,11. L’efficienza di accoppiamento tra aploidi è stata utilizzata come misura della speciazione in ceppi evoluti in laboratorio, così come tra specie esistenti¹².

Essendo un semplice organismo eucariotico, il lievito è il modello di scelta per un gran numero di domande di ricerca associate a organismi eucarioti complessi. Una di queste domande è associata alla speciazione e all’evoluzione delle barriere riproduttive^13,14. Per gli organismi che si riproducono sessualmente, una specie è definita dal concetto di specie biologica (BSC) proposto da Ernst Mayr¹⁵. Secondo questo concetto, due individui di una popolazione appartengono a due specie diverse se non possono incrociarsi e sono isolati in modo riproduttivo. La rottura del ciclo riproduttivo sessuale (che comporta la fusione dei gameti per formare uno zigote, lo sviluppo dello zigote in una progenie e il raggiungimento della maturità sessuale nella progenie) porta all’isolamento riproduttivo. Come mostrato nella figura 1, il ciclo vitale di S. cerevisiae è paragonabile al ciclo riproduttivo sessuale: a) la fusione dei due tipi di accoppiamento a e α è simile alla fusione dei gameti negli organismi che si riproducono sessualmente; b) la capacità del diploide di subire una divisione mitotica è equivalente allo zigote che si sviluppa in progenie; e c) la sporulazione diploide è paragonabile al processo di gametogenesi¹⁴.

L’isolamento prezigotico si verifica quando si osserva l’accoppiamento assortitivo. Data un’uguale opportunità di accoppiarsi con due tipi geneticamente diversi, un tipo α si accoppia preferenzialmente con uno rispetto all’altro o viceversa¹⁴. Nel caso di esperimenti di evoluzione in cui gli aploidi si sono evoluti in ambienti diversi, la presenza di una barriera pre-accoppiamento può essere determinata eseguendo un test di accoppiamento. Una diminuzione dell’efficienza di accoppiamento rispetto all’antenato indica l’evoluzione di una barriera pre-accoppiamento. L’isolamento post-zigotico potrebbe insorgere a causa dell’incapacità del diploide di subire un’efficace divisione mitotica e/o sporulazione per formare spore aploidi¹⁴. Questi possono essere quantificati misurando rispettivamente il tasso di crescita dei diploidi e calcolando l’efficienza di sporulazione. Quindi, per studiare l’evoluzione delle barriere riproduttive, sono necessari metodi robusti per quantificare (a) l’efficienza di accoppiamento, (b) la crescita mitotica del diploide e (c) l’efficienza di sporulazione del diploide. In questo lavoro, viene riportato un metodo robusto per quantificare l’efficienza di accoppiamento dei ceppi di lievito.

Negli esperimenti di laboratorio, uno dei modi in cui è possibile rilevare il verificarsi dell’accoppiamento è utilizzando marcatori auxotrofi che completano le esigenze nutrizionali. Quando i due tipi di accoppiamento sono auxotrofi per due diversi amminoacidi, solo la cellula diploide formata dalla fusione dei due tipi di accoppiamento può crescere su un terreno carente di entrambi gli amminoacidi. Pertanto, i marcatori auxotrofi sono utili per rilevare l’accoppiamento sia qualitativamente che quantitativamente. Un test qualitativo sarà sufficiente per identificare il tipo di accoppiamento di un ceppo dopo la meiosi¹⁶. I test quantitativi sono essenziali quando si è interessati a identificare una riduzione dell’accoppiamento mentre si studiano i geni coinvolti nel percorso di accoppiamento^17,18. Inoltre, con il lievito sempre più utilizzato negli studi di speciazione, è necessario un saggio di accoppiamento conveniente e riproducibile, poiché la quantificazione dell’efficienza di accoppiamento è una misura della barriera prezigotica.

L’efficienza di accoppiamento tra i due tipi di accoppiamento del lievito è stata quantificata in precedenza^16,19,20. La maggior parte dei metodi precedentemente utilizzati sono simili nel loro design con alcune varianti 16,21,22,23,24,25. Alcuni di loro usano colture di fase logaritmica precoce, mentre alcuni altri usano colture di ceppi aploidi in fase intermedia. Ci sono variazioni nei rapporti in cui i due tipi di accoppiamento sono mescolati. Quasi tutti i protocolli utilizzano una membrana di nitrocellulosa. Le sospensioni di entrambi i tipi di accoppiamento prelevate da colture precedentemente coltivate vengono miscelate e filtrate su una membrana di nitrocellulosa posta su una piastra YPD. In una delle varianti del protocollo, la sospensione aploide viene applicata direttamente su una piastra YPD²¹. Negli esperimenti che si occupano dei geni coinvolti nella produzione di feromoni dei due tipi di accoppiamento, i feromoni vengono aggiunti esternamente mentre si effettuano le sospensioni dei due tipi di accoppiamento²⁴.

Dopo l’incubazione per alcune ore (in genere circa 5 ore) dopo aver miscelato gli aploidi, le cellule vengono lavate via dalla membrana, diluite e placcate su terreni selettivi. In uno dei primi metodi riportati nel 1973, l’efficienza della formazione o dell’accoppiamento dello zigote è stata calcolata contando il numero di cellule gemmate, cellule non gemmate e coppie di accoppiamento al microscopio utilizzando un emocitometro²⁶. Tuttavia, la maggior parte dei metodi riportati in seguito utilizza marcatori auxotrofi per distinguere aploidi e diploidi. L’efficienza di accoppiamento è calcolata come la percentuale di cellule diploidi rispetto al numero di cellule diploidi e aploidi nel pool cellulare 16,21,23.

Tuttavia, nonostante un certo numero di rapporti che utilizzano il lievito come organismo modello per studiare la speciazione, non esiste un protocollo standardizzato riportato in letteratura fino ad ora per calcolare l’efficienza dell’accoppiamento. Le celle nella fase logaritmica potrebbero non essere ideali per la quantificazione dell’efficienza di accoppiamento. Durante l’accoppiamento, il ciclo cellulare dei due aploidi viene arrestato e, quindi, le cellule durante l’accoppiamento non si dividono⁹. Poiché il ciclo cellulare è anche noto per essere arrestato in modo simile nelle cellule nella fase stazionaria²⁷, l’uso di tali cellule può rendere il protocollo più riproducibile. Le cellule di fase stazionarie possono essere miscelate e disposte su piastre YPD (cioè un ambiente nutrizionalmente ricco) per l’accoppiamento. Le procedure convenzionali richiedono anche una membrana di nitrocellulosa e il lavaggio delle cellule, rendendo il processo ingombrante e soggetto a errori di gestione. Inoltre, i protocolli utilizzati fino ad oggi quantificano l’efficienza di accoppiamento in termini di un aploide. Tuttavia, quando si misura l’isolamento riproduttivo, l’efficienza di accoppiamento viene quantificata per una particolare combinazione di aploidi piuttosto che per un singolo aploide.

Per affrontare questi problemi, qui riportiamo un metodo robusto per la quantificazione dell’efficienza di accoppiamento nel lievito che è altamente riproducibile e facile da usare. Inoltre, questo metodo e i ceppi di lievito qui impiegati possono essere utilizzati anche in studi che esaminano l’effetto del flusso genico sull’evoluzione delle barriere di accoppiamento.

In questo studio sono stati utilizzati due diversi ceppi di S. cerevisiae. Uno dei ceppi deriva dal fondo SK1; questo è stato modificato nel nostro laboratorio aggiungendo i marcatori auxotrofi vicino al locus MAT. I genotipi risultanti degli aploidi sono riportati nella Tabella 1^28,29,30. Nel ceppo SK1, l’aploide a aveva il gene TRP1 inserito vicino al locus MAT, e l’aploide α aveva il gene LEU2 inserito vicino al locus MAT. Nel ceppo ScAM, i geni TRP1 e URA3 sono stati inseriti rispettivamente negli aploidi a e α. La posizione di inserimento era nella regione ARS del cromosoma III (Chr III: 197378..197609). Per il protocollo qui riportato, sarebbero sufficienti marcatori auxotrofi in qualsiasi punto del genoma. Tuttavia, avere i marcatori auxotrofi vicino al locus MAT significa che questi ceppi possono essere utilizzati anche per studi che esaminano l’effetto del flusso genico sulla speciazione^31,32. I marcatori sono stati aggiunti vicino al locus MAT per impedire il rimescolamento dei marcatori a causa della ricombinazione. Quindi, questo protocollo può essere utilizzato per quantificare l’efficienza di accoppiamento negli studi che coinvolgono la speciazione e anche per identificare l’alterazione dell’efficienza di accoppiamento quando si studiano le proteine coinvolte nel percorso di accoppiamento.

Protocol

NOTA: Il protocollo prevede in generale le seguenti fasi: (1) rattoppare gli aploidi nelle griglie di efficienza di accoppiamento su una piastra YPD, (2) mescolare gli aploidi in numero uguale dopo 24 ore di incubazione e dare agli aploidi misti alcune ore per accoppiarsi (7 ore in questo studio), (3) placcare le cellule miste su YPD per isolare singole colonie dopo 7 ore a 30 °C, e infine, (4) determinare il numero di diploidi formati utilizzando i marcatori auxotrofi. Questi passaggi sono discussi in dettaglio di seg…

Representative Results

Quantificazione dell’efficienza di accoppiamento dei due tipi di accoppiamentoIl protocollo qui descritto è stato utilizzato per quantificare l’efficienza di accoppiamento tra due ceppi di lievito: tra SK1AM a e SK1AM α e tra ScAMa e ScAMα (Figura 3A). In questi esperimenti, l’accoppiamento tra i due aploidi è stato ripetuto almeno 12 volte. In ciascuna delle ripetizioni dell’esperimento, almeno 100…

Discussion

La quantificazione dell’efficienza di accoppiamento in S. cerevisiae è essenziale per effettuare studi relativi ai geni coinvolti nelle vie di accoppiamento o studiare l’influenza dell’ambiente esterno sul comportamento di accoppiamento. Negli ultimi due decenni, S. cerevisiae è diventato anche un modello popolare per affrontare le questioni relative alla speciazione^{14,36,37,38</s…}

Materials

Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology	SRL	19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucose	Sigma Life Science	G8270
Glass Petri plates	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
L-Aspartic acid	Sigma Life Science	A7219
L-Histidine monochloride monohydrate	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Life Science	L8912
L-Lysine	Aldrich	62840
L-Methionine	Sigma Life Science	M5308
L-Phenylalanine	Sigma Life Science	P5482
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrosine	Sigma Life Science	T8566
L-Valine	Sigma Life Science	V0513
Mating efficiency grid			1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Yeast Extract Powder	HiMedia	RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate	BD Difco	233520