Определение эффективности спаривания гаплоидов у Saccharomyces cerevisiae

Summary

В данной работе описан робастный метод количественной оценки эффективности спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiae . Этот метод особенно полезен для количественной оценки презиготных барьеров в исследованиях видообразования.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae является широко используемым модельным организмом в генетике, эволюции и молекулярной биологии. В последние годы он также стал популярным модельным организмом для изучения проблем, связанных с видообразованием. Жизненный цикл дрожжей включает в себя как бесполую, так и половую репродуктивную фазы. Легкость проведения эволюционных экспериментов и короткое время генерации организма позволяют изучать эволюцию репродуктивных барьеров. Эффективность, с которой два типа спаривания (a и α) спариваются с образованием диплоида a/α, называется эффективностью спаривания. Любое снижение эффективности спаривания между гаплоидами указывает на презиготный барьер. Таким образом, для количественной оценки степени репродуктивной изоляции между двумя гаплоидами требуется надежный метод количественной оценки эффективности спаривания. С этой целью здесь представлен простой и легко воспроизводимый протокол. Протокол включает в себя четыре основных этапа, которые включают в себя исправление гаплоидов на пластине YPD, смешивание гаплоидов в равных количествах, разбавление и покрытие для отдельных колоний и, наконец, расчет эффективности на основе количества колоний на пластине. Ауксотрофные маркеры используются, чтобы четко провести различие между гаплоидами и диплоидами.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, обычно называемые почковающимися дрожжами, являются одноклеточными эукариотами. Он имеет два типа спаривания, a и α, и демонстрирует как бесполые, так и половые репродуктивные циклы. Типы спаривания a и α являются гаплоидами и могут митотически делиться в отсутствие другого типа спаривания в окружающей среде, который представляет собой бесполый цикл дрожжей. Когда два типа спаривания находятся в непосредственной близости, они перестают митотически делиться и сливаются, образуя диплоидную клетку. Диплоидные дрожжи могут либо делиться митотически при наличии питательных веществ, либо подвергаться мейозу в условиях азотного голодания в присутствии бедного источника углерода, который не поддается ферментации, такого как ацетат¹. Это приводит к образованию спор, которые остаются в состоянии покоя до тех пор, пока не появятся благоприятные условия для роста. Жизненный цикл завершается, когда эти споры прорастают, и два гаплоидных типа высвобождаются обратно в гаплоидный пул ^2,3 (рис. 1).

Спаривание дрожжевых клеток включает в себя несколько этапов, таких как агглютинация, образование проекции спаривания или «шму», за которой следует клеточный и ядерный синтез ^4,5. Два типа спаривания a и α производят a-фактор и α-фактор соответственно, чтобы инициировать спаривание. Эти факторы представляют собой полипептидные феромоны, которые связываются с рецепторами (Ste2 и Ste3), присутствующими на поверхности клеток противоположного типа^{спаривания 5}. Связывание феромонов с рецепторами инициирует путь феромонного ответа, путь передачи сигнала митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) ^6,7,8. Это приводит к остановке клеточного цикла в фазе G1, что приводит к метаболически активной стационарной фазе⁹. Затем клетки перестают митотически делиться, и синтезируются белки, необходимые для спаривания. Поскольку гаплоидные клетки не могут двигаться навстречу друг другу, брачная проекция или «шму» направлена на партнера по спариванию. Когда клетки вступают в контакт, клеточная стенка разлагается, и цитоплазматическое содержимое сливается, в результате чего происходит спаривание с образованием диплоидной клетки^10,11. Эффективность спаривания между гаплоидами использовалась в качестве меры видообразования в лабораторных штаммах, а также между существующими видами¹².

Будучи простым эукариотическим организмом, дрожжи являются моделью выбора для большого количества исследовательских вопросов, связанных со сложными эукариотическими организмами. Один из таких вопросов связан с видообразованием и эволюцией репродуктивных барьеров^13,14. Для организмов, размножающихся половым путем, вид определяется концепцией биологического вида (BSC), предложенной Эрнстом Майром¹⁵. Согласно этой концепции, две особи популяции считаются принадлежащими к двум разным видам, если они не могут скрещиваться и репродуктивно изолированы. Нарушение полового репродуктивного цикла (которое включает слияние гамет с образованием зиготы, развитие зиготы в потомство и достижение половой зрелости у потомства) приводит к репродуктивной изоляции. Как показано на рисунке 1, жизненный цикл S. cerevisiae сопоставим с половым репродуктивным циклом: а) слияние двух типов спаривания a и α аналогично слиянию гамет у организмов, размножающихся половым путем; б) способность диплоида подвергаться митотическому делению эквивалентна развитию зиготы в потомство; и в) диплоид, подвергающийся спороношению, сопоставим с процессом гаметогенеза¹⁴.

Презиготная изоляция происходит, когда наблюдается ассортативное спаривание. Имея равные возможности спариваться с двумя генетически разными типами , α тип предпочтительно спаривается с одним из них, а не с другим или^{наоборот14}. В случае эволюционных экспериментов, в которых гаплоиды эволюционировали в разных средах, наличие барьера перед спариванием можно определить, выполнив анализ спаривания. Снижение эффективности спаривания по сравнению с предком указывает на эволюцию барьера перед спариванием. Постзиготная изоляция может возникнуть из-за неспособности диплоида подвергаться эффективному митотическому делению и/или спороношению с образованием гаплоидных спор¹⁴. Они могут быть количественно оценены путем измерения скорости роста диплоидов и расчета эффективности спороношения, соответственно. Следовательно, для изучения эволюции репродуктивных барьеров требуются надежные методы количественной оценки (а) эффективности спаривания, (б) митотического роста диплоида и (в) эффективности спороношения диплоида. В этой работе сообщается о надежном методе количественной оценки эффективности спаривания штаммов дрожжей.

В лабораторных экспериментах одним из способов обнаружения возникновения спаривания является использование ауксотрофных маркеров, которые дополняют потребности в питании. Когда два типа спаривания являются ауксотрофными для двух разных аминокислот, только диплоидная клетка, образованная слиянием двух типов спаривания, может расти в среде, дефицитной для обеих аминокислот. Таким образом, ауксотрофные маркеры полезны для выявления спаривания как качественно, так и количественно. Качественного теста будет достаточно, чтобы определить тип спаривания штамма после мейоза¹⁶. Количественные тесты необходимы, когда кто-то заинтересован в выявлении сокращения спаривания при изучении генов, участвующих в пути спаривания^17,18. Кроме того, поскольку дрожжи все чаще используются в исследованиях видообразования, необходим удобный и воспроизводимый анализ спаривания, поскольку количественная оценка эффективности спаривания является мерой презиготного барьера.

Эффективность спаривания между двумя типами спаривания дрожжей была количественно определена ранее^16,19,20. Большинство ранее использовавшихся методов схожи по своей конструкции с несколькими вариациями 16,21,22,23,24,25. Некоторые из них используют культуры ранней логарифмической фазы, в то время как некоторые другие используют культуры средней логарифмической фазы гаплоидных штаммов. Существуют различия в соотношениях, в которых смешиваются два типа спаривания. Почти во всех протоколах используется нитроцеллюлозная мембрана. Суспензии обоих типов спаривания, взятые из ранее выращенных культур, смешивают и фильтруют на нитроцеллюлозную мембрану, помещенную на пластину YPD. В одном из вариантов протокола гаплоидная суспензия наносится непосредственно на пластину²¹ YPD. В экспериментах, связанных с генами, участвующими в производстве феромонов двух типов спаривания, феромоны добавляются извне при создании суспензий двух типов спаривания²⁴.

После инкубации в течение нескольких часов (обычно около 5 часов) после смешивания гаплоидов клетки смываются с мембраны, разбавляются и наносятся на селективные среды. В одном из более ранних методов, о которых сообщалось в 1973 году, эффективность образования или спаривания зиготы рассчитывалась путем подсчета количества отпочковавшихся клеток, непочковавшихся клеток и спаривающихся пар под микроскопом с использованием гемоцитометра²⁶. Однако большинство методов, о которых сообщалось позже, используют ауксотрофные маркеры для различения гаплоидов и диплоидов. Эффективность спаривания рассчитывается как процентное соотношение диплоидных клеток к количеству диплоидных и гаплоидных клеток в клеточном пуле 16,21,23.

Однако, несмотря на ряд сообщений об использовании дрожжей в качестве модельного организма для изучения видообразования, до сих пор в литературе не сообщалось стандартизированного протокола для расчета эффективности спаривания. Клетки в логарифмической фазе могут быть не идеальными для количественной оценки эффективности спаривания. Во время спаривания клеточный цикл двух гаплоидов останавливается, и, следовательно, клетки во время спаривания не делятся⁹. Поскольку также известно, что клеточный цикл аналогичным образом останавливается в клетках в стационарной фазе²⁷, использование таких клеток может сделать протокол более воспроизводимым. Клетки неподвижной фазы можно смешивать и раскладывать на тарелках YPD (т.е. в богатой питательными веществами среде) для спаривания. Обычные процедуры также требуют нитроцеллюлозной мембраны и смывания клеток, что делает процесс громоздким и подверженным ошибкам. Кроме того, протоколы, используемые на сегодняшний день, количественно оценивают эффективность спаривания в пересчете на один гаплоид. Однако при измерении репродуктивной изоляции эффективность спаривания количественно определяется для конкретной комбинации гаплоидов, а не для одного гаплоида.

Чтобы решить эти проблемы, здесь мы сообщаем о надежном методе количественной оценки эффективности спаривания у дрожжей, который является высоковоспроизводимым и простым в использовании. Кроме того, этот метод и используемые здесь штаммы дрожжей также могут быть использованы в исследованиях, изучающих влияние потока генов на эволюцию брачных барьеров.

В этом исследовании использовались два разных штамма S. cerevisiae. Один из штаммов получен из фона SK1; это было изменено в нашей лаборатории путем добавления ауксотрофных маркеров вблизи локуса MAT. Полученные генотипы гаплоидов представлены в таблице 1^28,29,30. В штамме SK1 гаплоид a имел ген TRP1, вставленный рядом с локусом MAT, а гаплоид α имел ген LEU2, вставленный рядом с локусом MAT. В штамме ScAM гены TRP1 и URA3 были вставлены в гаплоиды a и α соответственно. Место вставки было в области ARS хромосомы III (Chr III: 197378..197609). Для протокола, представленного здесь, было бы достаточно ауксотрофных маркеров в любом месте генома. Однако наличие ауксотрофных маркеров вблизи локуса MAT означает, что эти штаммы также могут быть использованы для исследований, изучающих влияние потока генов на видообразование^31,32. Маркеры были добавлены близко к локусу MAT, чтобы предотвратить перетасовку маркеров из-за рекомбинации. Следовательно, этот протокол может быть использован для количественной оценки эффективности спаривания в исследованиях, связанных с видообразованием, а также для выявления изменения эффективности спаривания при изучении белков, участвующих в пути спаривания.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол в целом включает следующие этапы: (1) исправление гаплоидов в сетках эффективности спаривания на пластине YPD, (2) смешивание гаплоидов в равных количествах после 24-часовой инкубации и предоставление смешанным гаплоидам нескольких часов для спаривания (7 часов в этом ?…

Representative Results

Количественная оценка эффективности сопряжения двух типов сопряженияОписанный здесь протокол был использован для количественной оценки эффективности спаривания между двумя штаммами дрожжей – между SK1AM a и SK1AM α и между ScAMa и ScAMα (рис. 3A<…

Discussion

Количественная оценка эффективности спаривания у S. cerevisiae имеет важное значение для проведения исследований, связанных с генами, участвующими в путях спаривания, или изучения влияния внешней среды на брачное поведение. В последние два десятилетия S. cerevisiae также стала популярн…

Materials

Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology	SRL	19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucose	Sigma Life Science	G8270
Glass Petri plates	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
L-Aspartic acid	Sigma Life Science	A7219
L-Histidine monochloride monohydrate	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Life Science	L8912
L-Lysine	Aldrich	62840
L-Methionine	Sigma Life Science	M5308
L-Phenylalanine	Sigma Life Science	P5482
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrosine	Sigma Life Science	T8566
L-Valine	Sigma Life Science	V0513
Mating efficiency grid			1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Yeast Extract Powder	HiMedia	RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate	BD Difco	233520